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¿Qué tipo de muestra es más adecuado para la secuenciación del genoma completo en pacientes con AML? ¿Sangre periférica o médula ósea?

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Tengo la intención de realizar la secuenciación del genoma completo en pacientes con leucemia mieloide aguda para encontrar anomalías genómicas, en particular translocación y fusiones de genes. Sin embargo, no estoy seguro de si es mejor obtener sangre periférica o médula ósea o si no hay una preferencia significativa entre ellos.

Por favor, bríndeme recursos científicos para consultar.

Gracias de antemano.


La patogenia molecular de la recaída después del trasplante alogénico de células hematopoyéticas es poco conocida. Los datos sobre los mecanismos de recaída después del trasplante son escasos. Investigamos las aberraciones genómicas (AG) en 21 pacientes sometidos a trasplante de HLA compatible y no relacionado en blastos leucémicos antes del trasplante y en la recaída después del trasplante. Encontramos un mayor número de AG después del trasplante, lo que sugiere una mayor inestabilidad genómica durante la recaída. Dos de los 21 pacientes mostraron una gran región homocigota que abarca todo el locus HLA en el cromosoma 6p en la muestra de recaída. En ambos pacientes, la tipificación de HLA basada en la secuencia de los blastos reveló una pérdida del alelo específico del paciente en el locus no coincidente que conduce a la homocigosidad del haplotipo HLA compartido por el paciente y el donante. Además, se encontraron AG en regiones críticas como 12p13, 13q12.2 y 17p13. Nuestros resultados sugieren que escapar de la vigilancia inmunológica puede ser un mecanismo relevante de recaída después del trasplante en pacientes con AG en el cromosoma 6p. Una combinación de presión inmunológica continua mediada por células T del donante y la evolución clonal de la leucemia mieloide puede resultar en GA adquiridas después del trasplante.

Divulgación de información financiera: Ver agradecimientos en la página 1458.


Introducción

El linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL) es un trastorno linfoproliferativo crónico de células B de bajo grado que afecta predominantemente a pacientes de edad avanzada y afecta al bazo, la médula ósea y la sangre periférica [1]. Aunque la mediana de supervivencia es de alrededor de 10 años, aproximadamente el 70% de los pacientes con SMZL requieren tratamiento, de los cuales el 25% experimenta una enfermedad progresiva que conduce a una muerte prematura [1].

Nuestra comprensión de la patogénesis molecular de SMZL sigue siendo limitada. Los primeros estudios citogenéticos identificaron deleciones recurrentes de 7q31-q32 y duplicaciones de 3q en aprox. 30% y 20% de los casos, respectivamente [2], pero las investigaciones moleculares posteriores no han logrado identificar los genes causantes dentro de estas regiones [3]. Los estudios de genes candidatos se limitan a mutaciones en TP53, que se altera en un 10-15% de los casos [2], ya genes dentro de la vía NF-ƘB, que están mutados en un tercio de todos los casos [4, 5]. La presencia de un repertorio de genes de inmunoglobulina altamente restringido, en particular el uso selectivo de la variable de cadena pesada de inmunoglobulina (IGHV) 1-2 * 04 alelo en el 20-30% de los pacientes, sugiere que la estimulación antigénica puede ser importante en la patogénesis de esta enfermedad [6].

La reciente aplicación de la secuenciación del exoma completo al tejido esplénico congelado de 14 pacientes con SMZL seguida de una resecuenciación dirigida de variantes recurrentes en cohortes más grandes ha identificado más genes biológicamente relevantes [7,8]. Mutaciones en NOTCH2, que eliminan el dominio PEST C-terminal y dan como resultado una degradación de proteínas comprometida, se identificaron en el 20-25% de los casos, aunque no hubo consenso en cuanto a la importancia clínica de estas mutaciones entre los estudios [7,8]. También estuvieron implicadas mutaciones genéticas en moduladores u otros miembros de la vía de señalización Notch y en otras vías, como la remodelación de la cromatina y la regulación transcripcional [8].

En vista del número relativamente pequeño de pacientes investigados hasta ahora y la heterogeneidad biológica de SMZL, es vital realizar experimentos de descubrimiento de genes adicionales para catalogar completamente las lesiones moleculares que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Con este objetivo, realizamos la secuenciación del exoma completo y el análisis del número de copias del ADN del tumor y de la línea germinal extraído de una cohorte clínicamente homogénea de pacientes con SMZL. Al hacerlo, expandimos el directorio informado de genes de cáncer mutados de manera recurrente en esta enfermedad, ampliando así nuestra comprensión de la patogénesis de SMZL que, en última instancia, facilitará mejoras en el manejo de la enfermedad y la promesa de nuevas terapias.


Tecnologías de secuenciación de próxima generación

En la última década, el método de secuenciación convencional de Sanger ha sido superado por varios avances tecnológicos nuevos conocidos colectivamente como secuenciación de próxima generación (NGS). Estas tecnologías aplican diferentes estrategias de enriquecimiento de diana y amplificación clonal del ADN, lo que da como resultado la posibilidad de secuenciar millones de cadenas de ADN en paralelo. Esta secuenciación masivamente paralela facilita la secuenciación de alto rendimiento con una reducción significativa en los costos. El advenimiento de NGS ha acelerado significativamente el esfuerzo por comprender la base molecular de los cánceres [6]. El desarrollo reciente de “instrumentos NGS de sobremesa” como Ion Torrent PGM de Life Technologies y Mi-Seq de Illumina ha sido de gran utilidad en entornos clínicos y laboratorios individuales. Ion torrent PGM se basa en la secuenciación de semiconductores en la que la detección se realiza en un chip semiconductor. Esta tecnología detecta el cambio de pH debido a la liberación de iones de hidrógeno cuando se inserta un nuevo nucleótido durante la síntesis [7]. La tecnología Mi-Seq adoptó el enfoque de "secuenciación por síntesis" en el que la amplificación de la plantilla y el análisis de datos se combinan en un solo instrumento. Estos instrumentos son más pequeños, tienen un alto rendimiento, alta precisión y menos tiempo de funcionamiento. Además, estas máquinas proporcionan longitudes de lectura más cortas, lo que las hace más adecuadas para aplicaciones clínicas y de diagnóstico [8]. Se encuentran disponibles revisiones integrales que discuten varios aspectos tecnológicos de NGS y sus avances recientes [8-10].


Discusión

Aquí presentamos el desarrollo de un método de secuenciación de ARN dirigido para la detección y medición de MRD en AML. Este ensayo, que puede cubrir más de dos tercios de los pacientes en un único ensayo estandarizado (Figura 1), es muy específico, sensible y resistente a las variaciones en la profundidad de secuenciación y la plataforma utilizada durante la recopilación de datos. El estado de la ERM ahora está integrado en los criterios de respuesta para la LMA, 4 y las pautas de consenso del ELN para la medición ya están disponibles.6 El ensayo que se presenta aquí detecta todas las dianas moleculares incluidas en estas pautas.

Hasta la fecha, la detección de MRD molecular en AML se ha centrado principalmente en ensayos de qPCR de un solo objetivo.18 El uso de la secuenciación de próxima generación para la detección de MRD de AML ha comenzado a surgir, pero se ha centrado principalmente en el ADN como material de partida2721. El ensayo de secuenciación de ARN de MRD presentado aquí en teoría lo hace ideal para la detección de MRD, que incluye: (i) el uso de secuenciación de próxima generación permite tanto la multiplexación de objetivos como la flexibilidad para identificar mutaciones que podrían variar entre pacientes (variaciones en las secuencias de inserción de puntos de corte de fusión , etc.) (ii) el uso de cebadores dirigidos a anomalías recurrentes de AML aumenta en gran medida la sensibilidad del ensayo sobre la secuenciación de ARN o ADN en masa (iii) ARN ya que el material de partida permite el examen simultáneo de mutaciones / fusiones y cambia la expresión de la transcripción (iv) El ARN aumenta el límite de detección sobre el proporcionado por el ADN si la transcripción se expresa a un nivel mayor que el equivalente genómico por célula (v) UMIs al bajo para los niveles absolutos de cuantificación objetivo y (vi) los cebadores dirigidos durante la transcripción inversa aumentan el límite de detección y permiten un uso eficiente del material de partida. Sin embargo, es concebible que este ensayo de secuenciación de ARN pueda complementarse en el futuro con el uso de un enfoque de secuenciación de próxima generación de AML MRD basado en ADN (seguimiento, por ejemplo, de mutaciones somáticas en TP53, IDH1, IDH2, FLT3, etc.) que en conjunto permitirían cubrir casi los casos de AML.

Utilizando líneas celulares y muestras de pacientes que expresan los objetivos incluidos en nuestro ensayo, demostramos que el ensayo de secuenciación de ARN MRD de AML tiene una sensibilidad para la detección de enfermedades residuales de hasta 1 de cada 100.000 células (Figura 2). Es importante destacar que este límite de detección está muy por debajo del umbral de 1 de cada 1000 células sugerido actualmente por el consorcio ELN MRD6 y es comparable al de las técnicas moleculares de un solo objetivo estándar de oro (Figura 3). Además, debido al diseño centrado en MRD de nuestro ensayo, puede alcanzar una sensibilidad hasta 1000 veces mayor que la del ensayo de secuenciación de ARN dirigido más similar para las neoplasias mieloides disponibles en el mercado comercial (Figura 4). Sin embargo, dado que los niveles de expresión de ARN pueden variar de un paciente a otro, es importante señalar que los niveles de sensibilidad pueden variar y que no siempre se puede alcanzar un límite de detección de 1 en 100.000 células. Esta es una dificultad general que afecta a todos los métodos de detección de ERM basados ​​en ARN, incluida la qPCR, y se refleja en la recomendación de que la recaída molecular se determine mediante la progresión de las tendencias en múltiples puntos de tiempo en un paciente individual en lugar de mediante una única evaluación histórica. .6

Varias consideraciones importantes para la utilidad clínica de un ensayo MRD incluyen los requisitos de entrada de la muestra, el costo, el tiempo y la facilidad de adaptación del ensayo. Cada uno de estos factores se consideró en el diseño del ensayo. El uso de cebadores específicos y la adición de UMI durante el paso de transcripción inversa permiten un uso máximo del material de partida al tiempo que simplifica el flujo de trabajo (Figura 1B), que se puede completar en un solo día y es fácil de adoptar y / o automatizar. Además, con un requisito mínimo de secuenciación de solo 1-3 millones de lecturas (Figura complementaria en línea S4), se puede evaluar una sola muestra de paciente para obtener resultados inmediatos o se puede multiplexar en corridas a mayor escala para minimizar los costos (Tabla complementaria en línea S4). Es importante destacar que este flujo de trabajo analítico y de ensayo múltiple es flexible y ampliable. El diseño permite que todos los objetivos se examinen en el momento del diagnóstico, con la capacidad de adaptar el análisis a un subconjunto de objetivos específicos del paciente en puntos de tiempo posteriores para minimizar aún más los costos de secuenciación. Se pueden agregar fácilmente dianas adicionales al diseño del ensayo, lo que potencialmente permite la detección de otros marcadores de AML MRD, quimerismo, 2928 y pérdida de HLA30 para aquellos pacientes de AML de bajo riesgo que no están cubiertos de manera óptima por este ensayo pero que a menudo se someterán a un tallo alogénico. trasplante de células.

Si bien confirmamos la viabilidad del uso de esta prueba en la sangre y la médula ósea de los pacientes (Tabla 1, Figura 5), ​​se necesita trabajo futuro para probar la utilidad de esta técnica en grandes cohortes de pacientes y para determinar el impacto específico de la detección de ERM en Resultados de los pacientes con AML en este entorno. En general, creemos que este ensayo de secuenciación de ARN basado en UMI proporciona una herramienta de alto rendimiento, reproducible y ampliamente aplicable para la detección estandarizada de enfermedad residual en pacientes con AML.


Resultados

Diseño de una plataforma de secuenciación integrada de próxima generación para análisis genéticos integrales en leucemia mieloide aguda

Nuestra plataforma NGS para la caracterización genética integral de muestras de AML fue diseñada para permitir una detección rápida y confiable de aberraciones genéticas que son de importancia crítica para el diagnóstico, el pronóstico y la terapia en la AML en adultos.931 El flujo de trabajo completo que incluye tres preparaciones de bibliotecas NGS y análisis de datos por Se pueden completar cinco algoritmos diferentes en 5 días (Figura 1A).

Figura 1. Diagnóstico genético integral de leucemia mieloide aguda mediante secuenciación de próxima generación. (A) Esquema del flujo de trabajo: cada muestra se somete a la preparación de tres bibliotecas de secuenciación. Las bibliotecas se indexan por separado para la secuenciación en la misma celda de flujo. Los datos se analizan utilizando cinco algoritmos distintos para la detección de CNV, fusiones y variantes de ADN. Todo el flujo de trabajo se puede completar en 5 días si lo realiza una sola persona. Los tiempos para realizar los pasos individuales del ensayo compuesto se indican a la derecha. (B) Esquema del algoritmo CAI [N] para el análisis de CNV. Las lecturas se asignan a ventanas genómicas fijas de 1 Mb y las distribuciones de lectura se comparan con el promedio de más de 2500 cariotipos normales (Nmujer= 2.819, Nmasculino= 2.605) generado por muestreo aleatorio de lecturas de 150-250 pb del genoma de referencia. Una región se denomina amplificada o eliminada si el número de lectura observado en una ventana difiere significativamente (PAG& lt0.003) del promedio de en silico-cariotipos generados. (C) Ocupación de la celda de flujo por tres bibliotecas de secuenciación. Se pueden analizar dos muestras en paralelo en una secuencia de secuenciación en una celda de flujo MiSeq v2 estándar cuando las bibliotecas se secuencian con los números de lectura indicados en (A).

Con el fin de limitar los recursos de secuenciación necesarios a las capacidades de un dispositivo de secuenciación de sobremesa, abordamos las translocaciones relevantes para AML en el nivel de ARN utilizando PCR10 multiplex anclado para el enriquecimiento dirigido de transcripciones quiméricas. La detección basada en ARN de fusiones de genes comunes en la LMA y el cribado mutacional basado en el ADN ya están disponibles a través de kits comerciales prediseñados (Tablas complementarias en línea S1-S4) con software de análisis asociado. Por lo tanto, incluimos el cariotipo numérico en nuestra plataforma mediante una estrategia que no requiere un enriquecimiento específico del objetivo. En particular, realizamos una secuenciación del genoma completo de baja cobertura (lc-WGS), que se ha demostrado anteriormente para permitir una detección robusta de CNV.1211 Para el análisis de datos, desarrollamos algoritmos novedosos para la detección de CNV (Figura 1B) y KMT2A-PTD (CAI [N] y PTDi, respectivamente). Además, agregamos ITD-seek7 para la identificación de FLT3-ITD a los pipelines bioinformáticos disponibles para llamadas de fusión o mutación. Dependiendo del tamaño del panel de mutación, se pueden analizar una o dos muestras a la vez en una celda de flujo estándar (máximo 15 y veces 10 lecturas) (Figura 1C). Los costos operativos por muestra son comparables a los gastos totales de citogenética convencional, fluorescencia en el lugar hibridación (FISH) y análisis de mutaciones. En conjunto, nuestro enfoque integrado de NGS brinda información clínicamente significativa sobre los genomas de la AML de manera rápida y económica, lo que abre la posibilidad de informar las decisiones de tratamiento de manera temprana en función de las características moleculares y la información citogenética calculada.

Principios del algoritmo CAI [N] y estabilidad de cariotipos de referencia generados in silico

Para facilitar la interpretación clínica, modificamos el concepto de cariotipos "quovirtual" o "quodigital" 1413 y construimos "cariotipos calculados" a partir de datos de NGS que se asemejan a los cariotipos citogenéticos. Las CNV en el rango de bandas citogenéticas a cromosomas completos se identifican convenientemente usando un enfoque de profundidad de lectura15 y solo requieren una cobertura del genoma del 5-10% para la detección con una sensibilidad y especificidad & gt90%, 1716 correspondiente a 1-2 & times10 lecturas. CAI [N] compara las frecuencias de lectura en ventanas genómicas fijas de 1 Mb con en silico-generaron cariotipos de referencia normales y mapearon regiones amplificadas / eliminadas a bandas citogenéticas de modo que las ganancias o pérdidas cromosómicas se puedan informar usando notación citogenética (Figuras 1B y 2A). Los centrómeros no están cubiertos por nuestro método de cariotipo NGS, ya que incluyen secuencias repetitivas que evitan la alineación única de las lecturas de secuenciación.

Para examinar la estabilidad de en silico cariotipos de referencia, analizamos distribuciones de lectura en cromosomas completos y en ventanas de 1 Mb para cariotipos normales aleatorios femeninos y masculinos. Las frecuencias de lectura mostraron variaciones muy estrechas y más lecturas asignadas a los autosomas en los cariotipos masculinos que en las femeninas, lo que es consistente con menos lecturas asignadas al cromosoma Y en comparación con una segunda X (Figura 2B). Es de destacar que el cromosoma Y parece más pequeño que su tamaño real, también debido a secuencias repetitivas. Para investigar más a fondo si los datos de lc-WGS se parecen a los resultados de en silico experimentos aleatorios, secuenciamos dos bibliotecas de donantes femeninas sanas en 1-4 y 10 veces 10 lecturas. Los patrones de distribución de lectura coincidieron con en silico referencia en todas las profundidades de lectura examinadas (Figura 2C). Estos resultados confirman que lc-WGS se puede simular con precisión computacionalmente, lo que nos permite utilizar cariotipos normales aleatorios como referencia estable para los análisis de CNV.

Figura 2. Bandas cromosómicas calculadas y en silico-cariotipos de referencia generados. (A) Bandas cromosómicas calculadas mediante análisis CAI [N] de datos de lc-WGS. Se indican las distribuciones de lectura en ventanas genómicas a lo largo del cromosoma 9 de un paciente con AML (AML-2, Tabla 1) (izquierda: bandas citogenéticas, derecha: ventanas de 1 Mb. (B) Frecuencias de lecturas mapeadas de forma única en cromosomas completos para en silico-cariotipos normales generados. RF: mujer aleatoria (N = 2.819), RM: hombre aleatorio (N = 2.605). Las barras de error representan la desviación estándar (por debajo de la visibilidad & lt0.01%). Tenga en cuenta que en (A) el centrómero de un cromosoma no está cubierto y en (B) el cromosoma Y parece más pequeño que su tamaño real debido a las secuencias de ADN repetitivas, que impiden la alineación única de las lecturas de secuenciación. (C) Escalabilidad del algoritmo CAI [N]: Se secuenciaron cuatro bibliotecas de genoma completo de dos donantes femeninas sanas con diferentes números de lectura en ejecuciones de secuenciación multiplexada (panel derecho). Healthy F1.1-4: cuatro ejecuciones de la misma biblioteca.

Tabla 1. Muestras y cariotipos de pacientes y rsquo.

Detección de ganancias y pérdidas cromosómicas mediante cariotipo de variación del número de copias

Después de evaluar la coherencia de CAI [N] con cariotipos normales, determinamos su capacidad para detectar aberraciones numéricas. En primer lugar, examinamos a un individuo con síndrome de Down (T21) y la línea celular de meningioma benigno BEN-MEN-118 mediante análisis de lc-WGS y CAI [N]. Tanto la trisomía 21 en el probando T21 como la pérdida del cromosoma 22 en las células BEN-MEN-1 se identificaron correctamente (Figura 3).

Figura 3. Detección de ganancias y pérdidas de cromosomas completos mediante cariotipo de variación del número de copias. Se secuenciaron bibliotecas de genoma completo de (A) un individuo con síndrome de Down (T21) y (B) la línea celular BEN-MEN-1 con baja cobertura y se analizaron mediante CAI [N]. RF: mujer aleatoria (N = 2.819), RM: hombre aleatorio (N = 2.605). Las barras de error representan la desviación estándar (debajo de la visibilidad).

A continuación, investigamos las supresiones o adiciones de partes del cromosoma en tres muestras de pacientes con LMA y rsquo que mostraban pérdida del brazo largo del cromosoma 5 (Tabla 1, Figuras complementarias en línea S1-S3). CAI [N] recuperó deleciones 5q con diferentes puntos de corte que coincidían estrechamente con los resultados del laboratorio de referencia (Figura 4A, Tabla 1). Además, se detectó una ganancia del cromosoma 1p en el paciente AML-1, consistente con una trisomía parcial 1p reportada previamente (Figura 4B, Figura complementaria en línea S1, Tabla 1).

Figura 4. Detección de pérdidas y ganancias cromosómicas parciales por cariotipo de variación del número de copias. Las bibliotecas de genoma completo de tres pacientes con leucemia mieloide aguda y muestras de rsquo fueron secuenciadas con baja cobertura y analizadas por CAI [N]. (A) Gráficos de región para el cromosoma 5. (B) Gráfica de región del cromosoma 1 para el paciente AML-1. Los números de lectura en ventanas de 1 Mb se normalizaron a 1 & times10 6 lecturas totales. RF: mujer aleatoria (n = 2.819), RM: hombre aleatorio (n = 2.605). Ver también Figuras complementarias en línea S1-S3.

Finalmente, para probar la capacidad de nuestro enfoque para identificar ganancias o pérdidas cromosómicas que no se detectan fácilmente mediante bandas citogenéticas, realizamos el cariotipo de CNV en dos líneas celulares de AML, HL-60 y NB-4. Observamos patrones complejos de alteraciones en el número de copias en ambas líneas celulares, incluida una sobrerrepresentación masiva de 8q24.21 (que contiene el MI C locus) con pérdida de las partes restantes del cromosoma 8 (Figuras complementarias en línea S4A, B, S5 y S6, Tablas complementarias en línea S5 y S6), como se describió anteriormente. De manera similar, el análisis de PCR cuantitativa de tres loci en el cromosoma 7q (ARHGEF5, PIK3CG, VKORC1L1) confirmaron que esta región se amplificó en células NB-4 y no se perdió en AML-2 (Figuras complementarias en línea S2 y S4C, Tabla 1).

En resumen, nuestros resultados demuestran que lc-WGS seguido de análisis CAI [N] identifica correctamente los cambios en el número de copias con alta resolución y permite que genes específicos se vinculen directamente a regiones amplificadas o eliminadas.

Sensibilidad del cariotipo de variación del número de copias de CAI [N]

Para probar la sensibilidad de nuestro enfoque de cariotipado, realizamos análisis de lc-WGS y CAI [N] en una serie de diluciones de ADN BEN-MEN-1 en ADN de donantes sanos. Además, investigamos muestras con diferentes contenidos de blastos que se prepararon después del enriquecimiento de células positivas para CD34 de la sangre periférica del paciente con AML-4 mediante separación de perlas magnéticas27. La pérdida del cromosoma 22 fue fácilmente detectable en mezclas que contenían tan solo un 10% de BEN -ADN DE HOMBRE-1 (Figura 5). La deleción del cromosoma 7q se recuperó mediante cariotipo de CNV para el contenido de blast & ge20% con puntos de corte casi idénticos (Figura complementaria en línea S7, Tabla 1). Como la pérdida del cromosoma 7q no estaba presente en todas las células de la población de blastocitos positivos para CD34 (Tabla 1), el límite de detección para esta aberración fue ligeramente más alto que para la monosomía 22, que se encuentra en todas las células BEN-MEN-1. Estos hallazgos indican que la sensibilidad del cariotipo CAI [N] -CNV es suficiente para detectar aberraciones cromosómicas altamente prevalentes en muestras de AML con un recuento de blastos de al menos el 20% sin enriquecimiento previo de la población de blastos.

Figura 5. Sensibilidad del cariotipo de variación del número de copias. Se diluyó ADN genómico de la línea celular BEN-MEN-1 (monosomía 22) en ADN de donante sano (F1 sano, Figura 2) en diferentes proporciones y se sometió a análisis de lc-WGS y CAI [N]. (A) Gráficos de región para el cromosoma 22. El rango y las desviaciones estándar plusmn3 alrededor de la media se indican en rojo pálido. (B) Parcelas de decisión de la CNV. Los números de lectura en ventanas de 1 Mb se normalizaron a 1 & times10 6 lecturas totales. RF: hembra al azar (N = 2.819). Codificación de colores en (B) como en (A).

Detección de variantes de ADN y genes de fusión

Nuestro ensayo compuesto se basa en paneles de amplicones prediseñados para la detección de transcripciones de fusión y variantes de ADN. Las estrategias de amplificación implementadas en estos kits10 o, respectivamente, paneles específicos, ya han sido evaluadas extensamente.287 Por lo tanto, enfocamos nuestros estudios en la detección de todas las translocaciones que definen subclases y todos los tipos principales de variantes de ADN clínicamente relevantes en la LMA en adultos. Para investigar la cobertura de genes de fusión importantes, analizamos líneas celulares y muestras de pacientes que albergan o carecen de transcripciones quiméricas frecuentes. Todas las fusiones esperadas se identificaron en KASUMI-1,29 ME-1,30 NB-4,21 AML-5, AML-6 y CML-1, incluidas dos variantes31 de BCR-ABL1 en la última muestra. Por otro lado, no se detectaron fusiones en células HL-6019 y en un paciente con síndrome hipereosinofílico (HES-1), según lo informado por el laboratorio de referencia (Figura complementaria en línea S8A, Tabla complementaria S7 en línea). En un conjunto de las cuatro líneas celulares, se recuperaron todas las fusiones, pero en una dilución 1:25 de las mismas, solo las RUNX1-RUNX1T1 se identificó la transcripción de fusión. Este hallazgo subraya que la detección de fusión basada en ARN depende de la expresión, por lo que la sensibilidad del ensayo varía para diferentes muestras y fusiones.

Además, probamos de manera ejemplar el panel TruSight Myeloid (Illumina) y el panel QIASeq & trade Myeloid Neoplasms (Qiagen), que incorpora códigos de barras moleculares para la corrección de errores de PCR, 32 como herramientas de detección para identificar variantes cortas de ADN en genomas de AML. Todas las variantes de un solo nucleótido detectadas en las células HL-60, NB-4, ME-1, MV4-11 y SKNO-1 por el panel TruSight Myeloid fueron consistentes con los datos de COSMIC33 o confirmadas por la secuenciación de Sanger, y el panel QiaSeq & trade descubrió todas las mutaciones informadas en muestras de dos pacientes con AML (Tabla complementaria en línea S8). La secuenciación de una serie de diluciones de ADN de MV4-11 reveló límites de detección para las dos mutaciones de p53 del 1% y el 10% con los paneles TruSight & reg y QiaSeq & trade, respectivamente (Figura complementaria en línea S8B). Por tanto, la secuenciación de amplicones permite la detección de variantes con sensibilidades analíticas que, en regiones bien cubiertas, son equivalentes a las de la secuenciación de Sanger, el método de referencia para las pruebas de mutación clínica3534.

Variantes de secuencia de ADN más grandes como FLT3-ITD y KMT2A-PTD requiere especial atención en el análisis de datos de NGS, ya que pueden pasar desapercibidos por las herramientas de llamada de variantes comunes3736. identificó una inserción de 34 pb en FLT3 exón 14, que coincidió estrechamente con los resultados publicados, 38 con una sensibilidad analítica del 10% (Figura complementaria en línea S9A). los FLT3-No se detectó ITD en la muestra al 10% MV4-11 utilizando el panel QiaSeq & trade con análisis smCounter, presumiblemente debido a la cobertura subóptima lograda en nuestras ejecuciones de secuenciación. Sin embargo, dado que nuestro trabajo con kits comerciales tenía como objetivo aclarar su principal aplicabilidad con fines diagnósticos, no repetimos estos experimentos.

Para la identificación de KMT2A-PTD en los datos de secuenciación de amplicones, desarrollamos PTDi adaptando una herramienta que se había utilizado previamente con un enfoque de secuenciación dirigida basado en captura.36 El análisis de PTDi reveló la amplificación de los exones 3-8 en el paciente AML-7 con un e3e9 conocido KMT2A-PTD (Figura complementaria en línea S9B, tabla complementaria en línea S9). Por tanto, no sólo se pueden detectar variantes cortas de ADN mediante secuenciación de amplicones, sino también ITD y PTD difíciles. Tomados en conjunto, nuestros resultados confirman claramente que la combinación de paneles de amplicones basados ​​en ARN y ADN permite que NGS descubra todas las translocaciones importantes y todos los tipos de mutaciones clínicamente relevantes en la LMA.

Evaluación de la plataforma de secuenciación integral de próxima generación para el diagnóstico de leucemia mieloide aguda en un entorno clínico

Después de probar el rendimiento de todos los módulos de secuenciación y procedimientos bioinformáticos, evaluamos la utilidad clínica de nuestra plataforma como herramienta de diagnóstico. Como nuestros estudios de cariotipo en líneas celulares mostraron claramente que NGS detecta un mayor número de aberraciones numéricas que las bandas cromosómicas (Tablas complementarias en línea S5 y S6), primero investigamos una posible necesidad de revisión manual de la salida de CAI [N] sin procesar para evitar la sobreestimación de la complejidad del cariotipo y permitir una estratificación de riesgo adecuada (Tabla 1, Tablas complementarias en línea S10 y S11). Realizamos lc-WGS en muestras de pacientes adicionales y rsquo y cariotipos reconstruidos de NVC mediante comparación cruzada de resultados de CAI [N] y hallazgos citogenéticos conocidos. Todos los cariotipos no complejos, incluidas tres muestras con cariotipos presuntamente normales en los que el análisis citogenético había fallado, se identificaron correctamente (AML-5, -7-11a / b, -13, -16, -17, -19, HES-1 / AML-14, -15, -20). En dos muestras que no se habían caracterizado extensamente por FISH, el cariotipado de CNV aparentemente identificó cromosomas marcadores o detectó aberraciones adicionales (AML-2 / AML-1). Además, CAI [N] reveló cambios en el número de copias de cinco de los seis cromosomas implicados en translocaciones en un cariotipo altamente complejo (AML-3), pero no perdió el cromosoma 10, que se había detectado en & lt10% de las células mediante FISH en interfase. En cuatro pacientes, para quienes no se había realizado la citogenética cuando se tomaron las muestras, NGS recuperó al menos un subconjunto de clones aberrantes o un cariotipo normal como se informó en el diagnóstico inicial (AML-4, -6, -12 / AML-18, respectivamente ). En conjunto, la complejidad general del cariotipo se determinó correctamente en todos los casos y 13/13 muestras sin translocaciones que definen el riesgo se asignaron con precisión a grupos de pronóstico basados ​​en el cariotipo de NVC solo (Tabla complementaria en línea S10). Por lo tanto, no validamos específicamente los resultados discordantes entre el cariotipo convencional y NGS.

A continuación, para estudiar las muestras de pacientes y rsquo de manera imparcial, un grupo de cuatro de los autores realizó un análisis ciego de NVC, genes de fusión y mutaciones en ocho muestras adicionales de AML y una muestra de leucemia linfocítica aguda (AML-21 & ndash28, ALL-139 Tabla 1, Tablas complementarias en línea S7-S9). Se excluyeron dos muestras antes de desenmascarar debido a una cobertura de lectura insuficiente como resultado de la mala calidad del ADN (AML-26, -27). En las muestras restantes, el cariotipo de NVC descubrió todos los cambios numéricos esperados y una aberración adicional, la ganancia del cromosoma 19 en el paciente AML-28. El análisis de fusión identificó todas las translocaciones descritas previamente en estos pacientes. El análisis de variantes no reveló variantes, inserciones, deleciones o ITD de un solo nucleótido en esta serie de muestras, de acuerdo con los resultados de referencia. Estos hallazgos subrayan aún más el valor diagnóstico potencial de nuestro ensayo para el tratamiento clínico de la LMA.


4 OTRAS ETIOLOGÍAS DE LA INSUFICIENCIA HIPOPLÁSTICA DE LA MÉDULA ÓSEA

Como se mencionó brevemente en las secciones anteriores sobre AA y h-MDS, el proceso de diagnóstico de enfermedades consideradas como insuficiencia de la médula ósea hipoplásica se complica con frecuencia debido a una amplia gama de diagnósticos diferenciales. Las biopsias de médula ósea se implementan de forma rutinaria en el algoritmo diagnóstico en algún momento después de que se realiza una evaluación clínica adecuada, con el objetivo de descartar la manifestación de insuficiencia de la médula ósea por otras etiologías distintas de las enfermedades hematológicas. La pancitopenia, que en sí misma no es una enfermedad, sino simplemente un síntoma de un trastorno subyacente que afecta la médula ósea y las líneas celulares periféricas, puede atribuirse tanto a una afección no maligna o hereditaria como a una neoplasia maligna manifiesta. 73 Las causas no malignas de pancitopenia incluyen toxicidad como consecuencia del efecto del fármaco o de la irradiación, infecciones, deficiencias nutricionales, enfermedades autoinmunes, secuestro esplénico, HPN y linfohistiocitosis hemofagocítica. 73 Además, existe un grupo significativo de pacientes que presentan citopenias inexplicables sin cumplir por completo los criterios de diagnóstico de enfermedades hematológicas, lo que se denomina citopenia idiopática de importancia indeterminada (ICUS). 24 La citopenia clonal de significado indeterminado (CCUS) es un subgrupo de ICUS, en el que se identifica una mutación en al menos un gen causante de la enfermedad. 74 A pesar de esto, un estudio 75 recientemente publicado especuló, como reflejo de su descubrimiento de la presencia de mutaciones entre los pacientes con ICUS, que las mutaciones en ASXL1 podría ser el primer éxito en la progresión a MDS. Otros estudios 76, 77 han demostrado que las tecnologías NGS pueden ser útiles en la detección de mutaciones asociadas a MDS en cohortes de pacientes que presentan citopenias inexplicables. Sus hallazgos sugieren que los descubrimientos mutacionales de NGS pueden ayudar a identificar a los pacientes con riesgo de progresión de la malignidad. Sin embargo, los dos estudios informan resultados contradictorios con respecto a la progresión de la enfermedad a MDS / AML. Fernandez-Pol et al 76 defienden, a la luz de su cohorte libre de progresión, que los resultados de la NGS deben interpretarse con precaución en el contexto de citopenias inexplicables. On the other hand, Hansen et al 77 argue for careful medical follow-up in the setting of unexplained cytopenias, while presenting a progression rate of 7 out of 60 patients. A large prospective cohort 23 demonstrated that mutational profiling of peripheral blood cells using NGS has high predictive value for the identification of patients who already have, or are prone to develop a myeloid malignancy. The study revealed that patients with CCUS had a 14-fold higher risk of progression to myeloid neoplasms (MDS/AML) compared to patients without clonal changes (ICUS). 23 The progression rate of CCUS depends not only on the existence of mutations, but also on the number of mutated genes, their clone size and the specific VAFs of the individual mutations. 23 In a newly published article, Malcovati et al 78 demonstrated that the discovery of SF3B1 mutations among CCUS patients, almost invariably, is associated with later development of manifest MDS with ring sideroblasts. They further suggest that mutations in SF3B1 are indicative of MDS in the setting of persistent, unexplained cytopenia, which in turn, may have implications on treatment strategies and risk stratification. 78 Two other studies 79, 80 have demonstrated that NGS has led to the validation of a firm haematological diagnosis in patients presenting with unexplained cytopenias.


Materiales y métodos

Patients and samples

We recruited 335 adult patients newly diagnosed with de novo non-M3 AML at the National Taiwan University Hospital with adequate cryopreserved bone marrow (BM) specimens. AML was diagnosed according to the 2016 World Health Organization (WHO) criteria. 17 Patients with antecedent cytopenia, hematologic disease, or therapy-related AML were excluded. This retrospective study was approved by the National Taiwan University Hospital Research Ethics Committee, and written informed consents were obtained from all participants in accordance with the Declaration of Helsinki. All patients achieved a morphologic CR, defined by the 2017 ELN recommendation, 18 after standard induction chemotherapy and received 2 to 4 courses of postremission chemotherapy with high-dose cytarabine with or without anthracycline. 19 The patients who achieved CR with incomplete hematologic recovery were not included. The choice of allogeneic HSCT was based on chromosomal findings, age, availability of donors, and response to induction treatment, evaluated by morphologic observation and MFC examination, which is a routine test in our institute. The pre-HSCT status was defined by cytomorphologic evaluation. NGS MRD analysis results were made unavailable to physicians to avoid bias in the choice of consolidation options. The median follow-up time of this cohort was 8.8 years (range, 0.3-23.3 years).

Gene mutation, cytogenetics, and flow cytometry analyses

We analyzed 1,005 BM samples serially collected at diagnosis, first CR after induction chemotherapy (first time point for MRD analysis), and after the first consolidation chemotherapy (second time point). We used the TruSight myeloid sequencing panel and HiSeq platform (Illumina, San Diego, CA) to survey mutations in 54 genes related to myeloid malignancies (supplemental Table 1). Library preparation and sequencing were performed according to the manufacturer’s instructions. The median reading depth was 10 550×. We used COSMIC database version 86, dbSNP version 151, ClinVar, PolyPhen-2, and SIFT to evaluate the consequence of every variant. The detailed variant analysis algorithm for diagnostic samples was described previously, 20 and the minimum variant allele frequency (VAF) for diagnostic samples was 5%. As shown in previous studies, 11,13 all variants detected at diagnosis were compiled to determine their background VAF error levels. The variant-specific error level was determined in all samples obtained from patients not carrying the specific variant at diagnosis. Variants with VAF more than mean background error plus 2 standard deviations of background error were selected for MRD analysis (supplemental Table 2). Because of the sequencing sensitivity issue, we excluded CEBPA mutations and FLT3-ITD in subsequent MRD analyses. The mutational status of these 2 genes at diagnosis was analyzed using previously described methods. 21

Cytogenetic analysis was performed and classified according to refined Medical Research Council criteria. 22 MRD monitoring was routinely done using MFC, as described previously. 23,24

Análisis estadístico

To evaluate the clinical robustness of prognostic models contributed by either the first or second MRD, we randomly divided the cohort into the training (80%) and validation (20%) sets. To minimize the bias introduced during this procedure, the division process was performed repeatedly 1000 times 1000 AUC values of the MRD 1st model, derived from the time-dependent receiver operating characteristic curve, 25 were compared with the other 1000 AUC values of the MRD 2nd model, using the paired Student t test in the validation cohort. The model construction process and other statistical methods are thoroughly described in supplemental Materials.


Patients and methods

Cohort

Included in the study were primary sequential specimens from 48 adult and 25 pediatric patients with AML from the Nordic countries, all of whom had relapsed or PR disease. All patients were diagnosed according to World Health Organization criteria. 19 Only cases with relapse or PR specimens of sufficient quality and yield available via the Uppsala Biobank or Karolinska Institute Biobank, collected from 1995 through 2016, were included. Cases of the clinically distinct acute promyelocytic leukemia (APL) subtype were excluded. Sixty-six patients had de novo AML, whereas the remaining 7 had a prior diagnosis of a myelodysplastic syndrome (MDS) or other malignancy. Associated clinical characteristics are summarized in Table 1, Figure 1, supplemental Tables 1-3, and supplemental Figures 1 and 2. Informed consent was obtained according to the Declaration of Helsinki, and study approval was acquired from the Uppsala Ethical Review Board (Sweden) and the Regional Ethics Committee South-East (Norway).

. Data .
Patients73 (100)
Adult cases 48 (65.8)
Elderly (≥60 y) 25 (34.2)
Adult (40-59 y) 17 (23.3)
Young adult (19-39 y) 6 (8.2)
Pediatric cases 25 (34.2)
Adolescent (15-18 y) 3 (4.1)
Child (3-14 y) 15 (20.5)
Infant (<3 y) 7 (9.6)
Sex, female 38 (52.1)
Fondo
De novo AML 66 (90.4)
Potential t-AML 3 (4.0)
MDS-AML 2 (2.7)
t-MDS-AML 2 (2.7)
Tumor samples138 (100)
Diagnosis samples 52 (37.7)
Relapse samples 80 (58.0)
R1 and R1-P 60 (43.5)
R2 and R2-P 16 (11.6)
R3 4 (2.9)
Primary resistant samples 6 (4.3)
Matched normal controls61 (100)
BMS cells 43 (70.5)
Complete remission samples 17 (27.9)
BMS/complete remission cell combination 1 (1.6)
Average age at onset, y
Adult cases 59.3 (range, 20.5-83.1 median, 61.7)
Pediatric cases 8.2 (range, 0.4-18.2 median, 7.7)
Average length of EFS, d (D>R1)
Adult relapse cases 624 (range, 34-5958 median, 306)
Pediatric relapse cases 365 (range, 69-1110 median, 312.5)
Average WBC
Adult cases* 100 (range, 1-395 median, 80)
Pediatric cases 104 (range, 11-232 median, 50)
NK-AML
Adult cases† 21 (46.7)
Pediatric cases 7 (28.0)
Sample purity 86% (>80% tumor cells range, 41-100)
Cell viability‡ 61% (≥75% viable cells range, 6-94)
Sampling duration 1995 through 2016
. Data .
Patients73 (100)
Adult cases 48 (65.8)
Elderly (≥60 y) 25 (34.2)
Adult (40-59 y) 17 (23.3)
Young adult (19-39 y) 6 (8.2)
Pediatric cases 25 (34.2)
Adolescent (15-18 y) 3 (4.1)
Child (3-14 y) 15 (20.5)
Infant (<3 y) 7 (9.6)
Sex, female 38 (52.1)
Fondo
De novo AML 66 (90.4)
Potential t-AML 3 (4.0)
MDS-AML 2 (2.7)
t-MDS-AML 2 (2.7)
Tumor samples138 (100)
Diagnosis samples 52 (37.7)
Relapse samples 80 (58.0)
R1 and R1-P 60 (43.5)
R2 and R2-P 16 (11.6)
R3 4 (2.9)
Primary resistant samples 6 (4.3)
Matched normal controls61 (100)
BMS cells 43 (70.5)
Complete remission samples 17 (27.9)
BMS/complete remission cell combination 1 (1.6)
Average age at onset, y
Adult cases 59.3 (range, 20.5-83.1 median, 61.7)
Pediatric cases 8.2 (range, 0.4-18.2 median, 7.7)
Average length of EFS, d (D>R1)
Adult relapse cases 624 (range, 34-5958 median, 306)
Pediatric relapse cases 365 (range, 69-1110 median, 312.5)
Average WBC
Adult cases* 100 (range, 1-395 median, 80)
Pediatric cases 104 (range, 11-232 median, 50)
NK-AML
Adult cases† 21 (46.7)
Pediatric cases 7 (28.0)
Sample purity 86% (>80% tumor cells range, 41-100)
Cell viability‡ 61% (≥75% viable cells range, 6-94)
Sampling duration 1995 through 2016

Data are number of patients (% of total group), unless otherwise stated. Detailed biological and clinical data for each patient/sample are presented in supplemental Tables 2 and 3.

BMS, bone marrow–derived stromal cells D, diagnosis NK-AML, normal karyotype AML at diagnosis R1/2/3, sequential relapses R1/2-P, persistent relapse specimen t-AML, treatment related AML WBC, white blood cell count (at diagnosis).

Information lacking for 6 adults.

Information lacking for 3 adults.

Accounts only for cryopreserved cells.

Event timeline of the study cohort. The time from diagnosis to longitudinal events for each patient is shown. Cases are depicted from top to bottom, grouped based on age at onset. Stars indicate occurrence of an allogeneic HSCT. Samples included in the current study as well as the next-generation sequencing method applied are indicated by filled circles (WGS, 90×), open circles (WGS, 30×), and diamonds (WES). Patients in remission at the latest follow-up are indicated with an ellipsis at the end of the respective bar. R1/2/3/4, sequential relapses HSCT, hematopoietic stem cell transplantation.

Event timeline of the study cohort. The time from diagnosis to longitudinal events for each patient is shown. Cases are depicted from top to bottom, grouped based on age at onset. Stars indicate occurrence of an allogeneic HSCT. Samples included in the current study as well as the next-generation sequencing method applied are indicated by filled circles (WGS, 90×), open circles (WGS, 30×), and diamonds (WES). Patients in remission at the latest follow-up are indicated with an ellipsis at the end of the respective bar. R1/2/3/4, sequential relapses HSCT, hematopoietic stem cell transplantation.

Preparación de la muestra

Mononuclear cells were enriched through Ficoll gradient centrifugation and cryopreserved or stored as frozen pellets until they were used. Cryopreserved AML specimens with leukemia cell content <80% were, if applicable, purified by immune-based depletion of nontumor cells (supplemental Table 4). Normal BM-derived stromal cells were cultivated from leukemic BM according to a published method 20 as a source of germline DNA. Genomic DNA was obtained with Qiagen extraction kits.

Library preparation and next-generation sequencing (NGS WGS: HiSeq X, Illumina [San Diego, CA] WES: Ion Proton, Thermo Fisher Scientific [Waltham, MA]) were performed at the Science for Life Laboratory (SciLifeLab), National Genomics Infrastructure (Uppsala, Sweden). Detailed information, including variant calling, filtering, and validation, is provided in supplemental Methods.

Estadísticas

Kaplan-Mayer curves and associated statistical tests were generated in GraphPad Prism 7.02. Other statistical tests were performed in R, 21 as detailed in supplemental Methods.


Endometrial and acute myeloid leukemia cancer genomes characterized

Two studies from The Cancer Genome Atlas (TCGA) program reveal details about the genomic landscapes of acute myeloid leukemia (AML) and endometrial cancer. Both provide new insights into the molecular underpinnings of these cancers with the potential to improve treatment. These studies represent the sixth and seventh in a series of genomes of at least 20 major cancers.

The first study is on endometrial cancer:

Study establishes basis for genomic classification of endometrial cancers proper categorization is important for choosing the best treatment

A comprehensive genomic analysis of nearly 400 endometrial tumors suggests that certain molecular characteristics - such as the frequency of mutations - could complement current pathology methods and help distinguish between principal types of endometrial tumors, as well as provide insights into potential treatment strategies. In addition, the study, led by investigators in The Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network, revealed four novel tumor subtypes, while also identifying genomic similarities between endometrial and other types of cancers, including breast, ovarian, and colorectal cancers.

These findings represent the most comprehensive characterization of the molecular alterations in endometrial cancers available to date. They were published May 2, 2013, in the journal Naturaleza. TCGA is funded and managed by the National Cancer Institute (NCI) and the National Human Genome Research Institute (NHGRI), both part of the National Institutes of Health.

"With this latest study in a series of 20 planned TCGA tumor type characterizations, more genomic similarities are emerging between disparate tumor types," said NIH Director Francis S. Collins, M.D., Ph.D. "Teasing out heretofore unknown genomic markers or mutations in various cancers is again proving the value of TCGA."

Clinically, endometrial cancers fall into two categories: endometrioid (type I) and serous (type II) tumors. Type I is correlated with excess estrogen, obesity, and a favorable prognosis, while type II is more common in older women and generally has a less favorable outcome. Type I tumors are often treated with radiation therapy, which helps stop or slow cancer growth, given in addition to or after the primary treatment. Type II tumors are generally treated with chemotherapy, in which drugs are used to kill the cancer cells or stop them from growing.

Distinguishing between different types of endometrial cancers is currently based on histology, an examination of a thin slice of tissue under a microscope. But categorizing endometrial cancer tissues is often difficult, and specialists frequently disagree on the classification of individual cases.

In this study, investigators showed that approximately 25 percent of tumors that pathologists classified as high-grade endometrioid showed frequent mutations in TP53, a tumor suppressor gene, as well as extensive copy number alterations, a term for when a cell has too many or too few copies of a genomic segment. Both are key molecular characteristics associated with serous tumors, along with a small number of DNA methylation changes, which are additions of a basic chemical unit to pieces of DNA. Most endometrioid tumors, by contrast, have few copy number alterations or mutations in TP53, though there are frequent mutations in other well known cancer-associated genes, including PTEN, another tumor suppressor gene, and KRAS, a gene involved in regulating cell division.

These data suggest that some high grade endometrioid tumors have developed a strikingly similar pattern of alterations to serous tumors, and may benefit from a similar course of treatment.

"This study highlights the fact that some tumors with the same characterization by pathologists may have very different molecular features. That's where these findings will be directly implemented in additional research, and also in the context of clinical trials," said Douglas A. Levine, M.D., head of the Gynecology Research Laboratory at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, and a co-leader in the study.

According to the authors, the new findings provide a roadmap for future clinical trials for endometrial cancer. "Each tumor subtype might warrant dedicated clinical trials because of the marked genomic differences between them that are indicative of different drivers of cancer," said study co-leader Elaine Mardis, Ph.D., co-director of the Genome Institute at Washington University School of Medicine, St. Louis. "Developing therapies for each subtype independent of the other may improve outcomes, as has been shown in breast cancer."

Investigators also found genomic similarities between endometrial cancers and other tumor types. Previous TCGA research showed that a form of ovarian cancer (high-grade serous ovarian carcinoma) and a subtype of breast cancer (basal-like breast cancer) share many genomic features. In this study, the scientists found that endometrial serous carcinoma also has some of these same genomic characteristics. The cancers share a high frequency of mutations in TP53 (between 84 and 96 percent) and a low frequency in PTEN, with only 1 to 2 percent mutated. Surprisingly, the researchers also found many shared characteristics between endometrioid tumors and colorectal tumors. Both cancer types demonstrate a high frequency of microsatellite instability, where the repair mechanism for DNA is broken, and mutations in POLE, a gene responsible for producing a protein involved in DNA replication and repair. These genomic changes led to high mutation rates in both tumor types.

"TCGA's multidimensional approach to collecting genomic data, including clinical and pathology information, have made these findings possible," said Harold Varmus, M.D., NCI director. "Without the integrated characterization of so many tumor samples, correlations between histology and genomic data may not have been observed or potential clinical outcomes identified."

With a complete analysis of the study's findings, investigators have identified four novel genomic-based subtypes of endometrial cancer, which may set the stage for new diagnostic and treatment approaches. Each of the four genomic subtypes clustered together and was named for one of its notable characteristics:

The POLE ultramutated group was named for its unusually high mutation rates and hotspot mutations (sequences highly susceptible to mutation) in the POLE gene. The hypermutated microsatellite instability group exhibited a high mutation rate, as well as few copy number alterations, but did not carry mutations in the POLE gene. The copy number low group showed the greatest microsatellite stability but a high frequency of mutations in CTNNB1, a gene critical for maintaining the linings of organs, such as the endometrium. The copy number high subtype was composed of mostly serous tumors, but included some endometrioid samples. This subtype displayed copy number alterations and a mutation landscape that was characteristic of serous tumors.

Endometrial cancer is the fourth most commonly diagnosed cancer among women in the United States. NCI estimates that close to 50,000 women will be diagnosed with endometrial cancer in 2013, with more than an estimated 8,000 deaths from the disease. For a majority of patients diagnosed with aggressive, high grade tumors with metastases, the five-year survival rate is about 16 percent, though chemotherapy has been associated with an improvement in survival, and new targeted agents are being tested.

"Finding genomic similarities among types of breast, ovarian, endometrial and colorectal tumors once again reveals that cancer, although very complex, may have themes extending beyond tissue type that can be exploited for therapeutic benefit," said Eric D. Green, M.D., Ph.D., NHGRI director. "These similar genomic features demonstrate hitherto unknown commonalities among these cancers.

To date, the TCGA Research Network has generated data and published analyses on glioblastoma multiforme, ovarian serous adenocarcinoma, colorectal adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma and invasive breast cancer. Data generated by TCGA are freely available at the TCGA Data Portal and CGHub.

This work was supported by the following grants from the NIH: 5U24CA143799-04, 5U24CA143835-04, 5U24CA143840-04, 5U24CA143843-04, 5U24CA143845-04, 5U24CA143848-04, 5U24CA143858-04, 5U24CA143866-04, 5U24CA143867-04, 5U24CA143882-04, 5U24CA143883-04, 5U24CA144025-04, U54HG003067-11, U54HG003079-10 and U54HG003273-10 and supplemented by the Recovery Act.

More details about The Cancer Genome Atlas, including Quick Facts, Q&A, graphics, glossary, a brief guide to genomics and a media library of available images can be found at http://cancergenome. nih. gov.

Reference: The Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated Genomic Characterization of Endometrial Carcinoma. Naturaleza. May 2, 2013. DOI:10.1038/nature12113.

The second study is on acute myeloid leukemia:

TCGA researchers identify potential drug targets, markers for leukemia risk New study reveals relatively few mutations in AML genomes

Investigators for The Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network have detailed and broadly classified the genomic alterations that frequently underlie the development of acute myeloid leukemia (AML), a deadly cancer of the blood and bone marrow. Their work paints a picture of a cancer marked by relatively few mutations compared to other types of cancer occurring in adults. They also found that AML is powerfully influenced by mutations in genes that cause epigenetic changes (chemical changes to the genome that do not change the DNA nucleotide sequence) that can affect the expression of genes. TCGA is jointly supported and managed by the National Human Genome Research Institute (NHGRI) and the National Cancer Institute (NCI), both part of the National Institutes of Health.

The findings, which appeared online May 1, 2013, in the Revista de Medicina de Nueva Inglaterra set the stage for identifying potential new drug targets and treatment strategies for AML. They may also offer better guidance for predicting the severity of disease for individual patients.

"These results provide important new insights into the genomics of a deadly and difficult-to-treat cancer, and underscore the power and scope of The Cancer Genome Atlas project," said NIH Director Francis S. Collins, M.D., Ph.D.

"Rather than just random snapshots about individual patients, this study provides a more detailed look at the aberrant genomes of AML than we have ever had before," said NHGRI Director Eric D. Green, M.D., Ph.D. "It has the potential to open up new directions in AML research, and perhaps, in the design of new therapeutics, its impact could be felt in the near future."

AML, the most common acute form of adult leukemia, develops when immature white blood cells fail to mature and instead accumulate in the bone marrow. The leukemia cells reduce the production of healthy blood cells, leading to anemia, abnormal bleeding and infections, and, if untreated, death.

Researchers examined the genomes of tumor specimens from 200 adult cases of spontaneously occurring, newly diagnosed AML. These cases represented all of the known subtypes of AML in approximately the same proportion as the general population. In this way, the study provided a realistic view of the disease, particularly in the number and frequency of genomic alterations. Each AML genome was compared to the normal genome derived from a skin sample of the same patient. Out of the 200 samples, 50 were analyzed by using whole genome sequencing, which is an examination of the complete DNA blueprint of the cells. Researchers analyzed the genome's protein-coding regions in the remaining samples, and used powerful new sequencing methods to look at changes in RNA in each case.

By studying a large number of AML cases, investigators were able to predict that they have identified virtually all of the mutations that occur in at least 5 percent of AML patients. Surprisingly, they found that overall, AML genomes have relatively few mutations, and such tumors are among the least mutated adult cancers. The average number of mutations in genes for each AML genome was 13, in contrast to solid tumors such as breast, lung or pancreatic cancer, which often have hundreds of mutated genes.

Because investigators found more than 1,600 genes that were mutated at least once in the 200 samples, they organized the recurrently mutated genes into nine categories based on their function or the known pathways involved. Some of these categories include tumor suppressor genes, signaling genes and epigenetic modifiers, with the latter being the most frequently mutated class of genes in the study. Epigenetic changes are alterations to DNA that often involve the addition or removal of chemical tags (such as methyl groups), which can affect when genes are turned on and off.

"This data set helps to integrate what was previously fragmented information," said study co-leader Timothy J. Ley, M.D., associate director for cancer genomics at The Genome Institute at Washington University School of Medicine in St. Louis. "We didn't realize how few recurrent mutations there were, and no one was thinking even five years ago that AML was associated with a high frequency of mutations in genes that encode epigenetic modifiers."

By finding comparatively few recurrently mutated genes, yet frequent alterations in genes that help control gene expression, the investigators may have narrowed the search for likely drug targets and disease markers.

Other results were also somewhat surprising. Researchers knew that mutations in signaling genes, which help control cell growth and development, were very common in AML, and thought that all AML samples may have at least one signaling gene mutation. But the TCGA findings showed that these genes are mutated in only 60 percent of cases. These include mutations in the gene FLT3, which occur in about a third of cases, making it one of the most commonly mutated genes in AML. FLT3 is important for normal blood cell development. The researchers also found that many AML patients have concurrent mutations in three commonly mutated genes: FLT3, NPM1 and DNMT3A. Patients with this combination of gene mutations appear to have a unique subtype of AML.

Investigators unexpectedly found recurring mutations in cohesin genes, which are important in cell division.

The study is the first to report a recurrently mutated microRNA gene in AML. MicroRNAs can play an important role in regulating gene expression, particularly in turning off gene activity.

Abnormal chromosome rearrangements and gene fusions (where two genes join to form a new, altered gene) are frequently useful in diagnosing and providing prognostic information for AML patients. The study uncovered many such fusions that had not been described before, and nearly half of the AML samples were found to have gene fusions.

Currently, only a few good markers exist to help guide treatment decisions for the majority of patients with intermediate risk. Some of the recurrently mutated genes identified in this study may allow for better prognostic information that will be relevant for AML patients.

"We've never had such a complete picture of AML, and this data set will be mined by researchers for years," said co-study leader Richard Wilson, Ph.D., director of Washington University's Genome Institute. "These findings have probably identified every pathway in which a modification - and perhaps new drugs - might be beneficial. They also further refine our understanding of the importance of individual mutations for disease classification and prognostication, and will help us build better disease models."

"These results will enable investigators to examine patient samples for mutation patterns and affected pathways, and to begin new studies to try to understand the relationships between these genetic mutations and treatment results," added Ley.

"This study of AML reinforces the value of the approach we are using to study the genomic diversity among tumors of many different cancer types and even within a single kind of cancer such as AML," noted NCI Director Harold Varmus, M.D. "Only such a systematic analysis of cancer types could have uncovered such clear patterns, such as the apparent importance in AML of genetic mutations that lead to changes in gene expression and cell traits."

This work was supported by the following grants: U24CA143845, U24CA143858, U24CA144025, U24CA143882, U24CA143866, U24CA143867, U24CA143848, U24CA143840, U24CA143835, U24CA143799, U24CA143883, U24CA143843, U54HG003067, U54HG003079, U54HG003273, and P01CA101937.

Reference: The Cancer Genome Atlas Network. Genomic and epigenomic landscape of adult de novo acute myeloid leukemia. Revista de Medicina de Nueva Inglaterra. Online May 1, 2013. In print May 30, 2013. DOI: 10.1056/NEJMoa1301689.

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Comentarios:

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