Información

¿Cómo puedo descargar un portaobjetos histológico de Cancer Digital Slide Archive?

¿Cómo puedo descargar un portaobjetos histológico de Cancer Digital Slide Archive?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

¿Podría decirme si es posible y cómo descargar datos de imágenes de http://cancer.digitalslidearchive.net?

Gracias.


El futuro de la patología digital

Michael Schubert, Luke Turner | 22/10/2020 | Lectura más larga

Aunque quedan algunos escépticos, el valor de la patología digital se reconoce cada vez más en todo el mundo, especialmente en esta era pospandémica. Los entusiastas digitales Jonhan Ho y Sylvain Mailhot revisan la situación actual y cómo se puede fomentar la adopción digital.

La patología digital es, a estas alturas, indiscutiblemente el futuro del campo. Aunque algunos todavía se muestran reacios a aceptar su lugar en el laboratorio, y a pesar de su lenta adopción en muchas instituciones, la imagen del portaobjetos digital está reemplazando lentamente al portaobjetos de vidrio en la platina del microscopio. La flexibilidad, la precisión y el potencial para implementar herramientas informáticas y de análisis de imágenes en constante mejora hacen que la patología digital sea una opción atractiva. Sin embargo, siguen existiendo obstáculos importantes: el gasto inicial, los flujos de trabajo interrumpidos y la infraestructura alterada necesarios para la implementación impiden que muchos laboratorios accedan a todo el potencial de la patología digital.

Sin embargo, el inicio de la crisis de COVID-19 a principios de 2020 solo sirvió para resaltar algunos de los beneficios clave de los sistemas digitales. Esas instituciones con patología digital permitieron a sus patólogos administrar mejor las cargas de trabajo y diagnosticar desde la comodidad y seguridad de su propio hogar. Los problemas regulatorios pueden obstaculizar la adopción digital, pero, a medida que nos adaptamos a las consecuencias prácticas de la pandemia, las comunidades médicas y regulatorias analizan cada vez más formas de combinar la digitalización de diapositivas y los beneficios del diagnóstico remoto. Para conocer más sobre la situación actual y hacia dónde se dirigen las cosas, hablamos con Jonhan Ho y Sylvain Mailhot, dos patólogos con experiencia digital.

Contenido patrocinado

¿Cómo puede la IA en el laboratorio beneficiar a patólogos y pacientes?

Únase a The Pathologist y ContextVision el 25 de marzo para escuchar a Filippo Fraggetta compartir su experiencia y los resultados clínicos del uso de INIFY Prostate Screening.

Tiempo para cambiar
Cuando Jonhan Ho vio por primera vez una imagen de diapositiva completa durante su residencia en patología, quedó impresionado. “Sabía que algún día todos estaríamos haciendo diagnósticos de forma rutinaria con patología digital”, dice. Al mismo tiempo, sin embargo, estaba cada vez más frustrado con el engorroso software médico que se ofrecía. “Estaba increíblemente frustrado por la cantidad de tiempo que perdimos haciendo clic en botones innecesarios. En ese momento sentí que teníamos una oportunidad única de influir en el futuro del software de patología durante las próximas décadas ". Una visión para el futuro condujo a flujos de trabajo de patología imperfectos forzados por un mal software, la otra a patólogos felices e inspirados en el trabajo, y Ho quería hacer todo lo que estuviera a su alcance para hacer de esto último una realidad.

Con el aumento de la pandemia, sus aspiraciones fueron oportunas. “COVID-19 realmente ha acelerado la necesidad del aprendizaje remoto y hemos cambiado toda nuestra enseñanza a imágenes de diapositivas completas”, explica Ho. Pero, a medida que la educación se democratiza cada vez más, notó una ausencia evidente: una plataforma para que los médicos, especialmente los patólogos, compartan sus conocimientos. Para resolver ese problema, Ho creó KiKo, un acrónimo de "conocimiento dentro, conocimiento fuera". Allí, los patólogos comparten colecciones de casos de imágenes de diapositivas completas junto con videos y otras formas de contenido. Y KiKo está despegando. Recientemente, la plataforma acogió su primera gran ronda mundial de dermatopatología digital, en la que dermatopatólogos de todo el mundo compartieron casos e intercambiaron sus mejores consejos y trucos.

“La patología digital empodera al patólogo”, dice Ho. “Ya no estamos encadenados a la ubicación del laboratorio de histología. Además de eso, la patología digital abre un nuevo conjunto de herramientas informáticas y de análisis de imágenes que recién ahora estamos comenzando a crear ". Sin embargo, advierte que no todo el software de patología digital ofrece una buena experiencia de usuario y que es importante inculcar a los proveedores la importancia de contar con diseñadores dedicados a la experiencia del usuario en su equipo.

Pero, ¿es ahora el momento adecuado para pasar a lo digital? Ho cree que sí. “Los sistemas hospitalarios ahorrarán dinero con la patología digital al disminuir los errores y distribuir dinámicamente las cargas de trabajo”, dice. "Tengo la esperanza de que, debido a que la pandemia ha puesto de relieve la necesidad, las agencias reguladoras estarán más dispuestas a permitir que los patólogos adopten la patología digital".

El mejor consejo de Ho: “Basura adentro = basura afuera. Para obtener imágenes limpias y buenas, el laboratorio de histología debe producir portaobjetos limpios y buenos ".

Demostrar la conveniencia digital
Después de que Sylvain Mailhot experimentó por primera vez las diapositivas digitales durante el proyecto de telepatología de diapositivas virtuales de la Universidad de Laval, se dio cuenta de su potencial ilimitado y estaba seguro de que el campo sería completamente digital en cinco años. ¿Por qué? “Tiene acceso inmediato a colegas en cualquier parte del planeta. Puede transferirles los archivos y obtener rápidamente una segunda opinión ”, explica Mailhot. “También puede ser difícil ubicar físicamente las diapositivas cuando sea necesario, por lo que poder acceder a ellas inmediatamente en un sistema digital ahorra mucho tiempo”. Mailhot también cree que la patología digital es más ergonómica que la configuración tradicional, con visores de diapositivas digitales que ofrecen una experiencia de trabajo más cómoda que sentarse encorvado sobre un microscopio.

Pero, ¿por qué no se ha adoptado plenamente la patología digital en todo el campo, como anticipó Mailhot hace una década? “Basado en mi experiencia trabajando con diapositivas digitales y discusiones con otros en Canadá y Estados Unidos, el principal obstáculo para la patología digital es la resistencia del patólogo”, dice. Mailhot cree que, para que la adopción digital tenga éxito, la cantidad de patólogos interesados ​​y entusiasmados con la patología digital debe alcanzar un umbral crítico. Reconoce que puede haber obstáculos en lo que respecta a la implementación digital, pero ninguno es imposible de superar. "Existe un retraso entre la producción de las diapositivas y la imagen digital al escanear sus propias diapositivas, por lo que es importante diseñar un sistema para priorizar las diapositivas importantes", explica Mailhot. "También habrá ocasiones en las que se sienta decepcionado con la calidad de la imagen digital, por lo que escaneamos manualmente todas las diapositivas para detectar áreas fuera de foco".

Es en parte gracias a la patología digital que el laboratorio de Mailhot se ha adaptado con éxito a los desafíos de COVID-19. Sin trabajo in situ permitido durante el encierro, la capacidad de diagnosticar casos digitalmente significaba que los patólogos podían operar desde la seguridad de sus hogares. Mailhot también destaca los beneficios del flujo de trabajo en caso de enfermedad. “Si un patólogo no puede trabajar, puedo reenviar inmediatamente los portaobjetos a otro patólogo del sistema. Antes, habría tenido que ir a su oficina para recuperar físicamente y redistribuir las diapositivas ".

Dada la tasa actual de adopción, ¿cómo se propone Mailhot convencer a los escépticos de que la patología digital es el camino a seguir? “Algunos patólogos tienen la idea errónea de que los portaobjetos digitales nunca se verán tan bien como el vidrio bajo un microscopio, y que requieren más tiempo para navegar. Para demostrar que este no es el caso, es importante mostrarles a estas personas diapositivas digitales en una pantalla de alta calidad utilizando un sistema avanzado para demostrar la calidad de la imagen y la facilidad de uso ". Una vez que la gente está a bordo, Mailhot cree que el segundo paso para una implementación exitosa es trabajar en estrecha colaboración con el departamento de TI. No se trata solo de tener una gran imagen, dice, sino también de tener suficientes instalaciones de red y almacenamiento para respaldar un sistema digital sin interrupciones.

Aunque la transición al diagnóstico digital de rutina puede resultar costosa para las instituciones al principio, Mailhot cree que los ahorros a largo plazo hacen que valga la pena. La consolidación de la producción de diapositivas digitales en un sitio, la distribución de diapositivas digitalmente y la mejora de la organización de las diapositivas ahorrarán dinero y tiempo a largo plazo. “Mirando más hacia el futuro, creo que las herramientas sofisticadas de inteligencia artificial (IA) obligarán a los laboratorios a volverse digitales”, dice Mailhot. "Una vez que se cumpla la promesa inicial de la IA, la preselección de diapositivas en categorías ahorrará tiempo y dinero".

Después de escanear diapositivas y diagnosticarlas digitalmente durante muchos años, Mailhot cree que instituciones como la suya tienen un papel clave que desempeñar. "Los laboratorios que ya han realizado la transición acumularán experiencia y conocimiento experto, y deben asegurarse de transmitirlo a otros para aumentar el valor de la patología digital y ayudar con la transición".

Consejo principal de Mailhot: “Creo que la gente tiene conceptos erróneos sobre la patología digital. Aconsejaría a todos que lo prueben. Mira las diapositivas con una pantalla, una computadora y un escáner de alta calidad, ¡y creo que te encantará! "

Jonhan Ho es profesor adjunto de Dermatología y Patología y Director de la Unidad de Dermatopatología del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.

Sylvain Mailhot es directora médica del PathAssistant Laboratory, Moncton, New Brunswick, Canadá.


Abstracto

Fondo

Para prácticamente todos los pacientes con cáncer colorrectal (CCR), se encuentran disponibles portaobjetos de tejido teñidos con hematoxilina-eosina (HE). Estas imágenes contienen información cuantitativa, que no se utiliza habitualmente para extraer de forma objetiva biomarcadores de pronóstico. En el presente estudio, investigamos si las redes neuronales convolucionales profundas (CNN) pueden extraer pronosticadores directamente de estas imágenes ampliamente disponibles.

Métodos y hallazgos

Delineamos a mano regiones de tejido único en 86 portaobjetos de tejido de CRC, obteniendo más de 100.000 parches de imagen HE, y los usamos para entrenar a una CNN mediante el aprendizaje de transferencia, alcanzando una precisión de nueve clases de & gt94% en un conjunto de datos independientes de 7.180 imágenes de 25 pacientes con CCR. Con esta herramienta, realizamos una descomposición tisular automatizada de imágenes de HE de múltiples tejidos representativas de 862 diapositivas de HE en 500 pacientes con CCR en estadio I-IV de la cohorte The Cancer Genome Atlas (TCGA), una gran colección multicéntrica internacional de tejido de CCR. Basándonos en las activaciones de neuronas de salida en la CNN, calculamos una "puntuación de estroma profundo", que era un factor pronóstico independiente para la supervivencia general (SG) en un modelo de riesgo proporcional de Cox multivariable (índice de riesgo [HR] con intervalo de confianza del 95% [ CI]: 1,99 [1,27–3,12], pag = 0,0028), mientras que en la misma cohorte, la cuantificación manual de las áreas estromales y una firma de expresión génica de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) solo fueron pronósticos en estadios tumorales específicos. Validamos estos hallazgos en una cohorte independiente de 409 pacientes con CCR en estadio I-IV del estudio “Darmkrebs: Chancen der Verhütung durch Screening” (DACHS) que fueron reclutados entre 2003 y 2007 en múltiples instituciones en Alemania. Nuevamente, la puntuación fue un factor pronóstico independiente para la SG (HR 1,63 [1,14-2,33], pag = 0,008), SG específica de CCR (HR 2,29 [1,5-3,48], pag = 0,0004) y supervivencia libre de recaídas (RFS HR 1,92 [1,34-2,76], pag = 0,0004). Se requiere una validación prospectiva antes de que este biomarcador se pueda implementar en los flujos de trabajo clínicos.

Conclusiones

En nuestro estudio retrospectivo, mostramos que una CNN puede evaluar el microambiente tumoral humano y predecir el pronóstico directamente a partir de imágenes histopatológicas.


Resultados

Aprendizaje de los resultados del paciente con redes neuronales convolucionales de supervivencia profunda.

La arquitectura del modelo SCNN se muestra en la Fig. 1 (la Fig. S1 muestra un diagrama detallado). Las secciones de tejido teñidas con H & ampE se digitalizan primero en imágenes de portaobjetos completos. Estas imágenes se revisan utilizando una plataforma basada en la web para identificar las regiones de interés (ROI) que contienen tumores viables con características histológicas representativas y que están libres de artefactos (Métodos) (34, 35). Los campos de alta potencia (HPF) de estos ROI se utilizan para entrenar una red convolucional profunda que se integra a la perfección con un modelo de riesgos proporcionales de Cox para predecir los resultados del paciente. La red está compuesta por capas interconectadas de operaciones de procesamiento de imágenes y funciones no lineales que transforman secuencialmente la imagen HPF en características de pronóstico altamente predictivas. Las capas convolucionales primero extraen características visuales del HPF a múltiples escalas utilizando kernels convolucionales y operaciones de agrupación. Estas características derivadas de imágenes se incorporan a capas completamente conectadas que realizan transformaciones adicionales y, luego, una capa final del modelo de Cox genera una predicción del riesgo del paciente. Los pesos de interconexión y los núcleos convolucionales se entrenan comparando el riesgo predicho por la red con la supervivencia u otros resultados de tiempo hasta el evento utilizando una técnica de retropropagación para optimizar la probabilidad estadística de la red (Métodos).

El modelo SCNN. El SCNN combina CNN de aprendizaje profundo con modelos de supervivencia tradicionales para aprender patrones relacionados con la supervivencia a partir de imágenes histológicas. (A) Se generan imágenes grandes de portaobjetos completos digitalizando portaobjetos de vidrio teñido con H & ampE. (B) Se utiliza un visor basado en web para identificar manualmente los ROI representativos en la imagen. (C) Se toman muestras de HPF de estas regiones y se utilizan para entrenar una red neuronal para predecir la supervivencia del paciente. El SCNN consta de (I) capas convolucionales que aprenden patrones visuales relacionados con la supervivencia mediante operaciones de convolución y agrupación, (ii) capas completamente conectadas que proporcionan transformaciones no lineales adicionales de características de imagen extraídas, y (iii) una capa de riesgos proporcionales de Cox que modela los datos del tiempo hasta el evento, como la supervivencia general o el tiempo hasta la progresión. Las predicciones se comparan con los resultados de los pacientes para entrenar de forma adaptativa los pesos de la red que interconectan las capas.

Para mejorar el rendimiento de los modelos SCNN, desarrollamos una técnica de filtrado de riesgo y muestreo para abordar la heterogeneidad intratumoral y la disponibilidad limitada de muestras de entrenamiento (Fig. 2). Durante el entrenamiento, los nuevos HPF se muestrean al azar de cada ROI al comienzo de cada iteración de entrenamiento, lo que proporciona al modelo SCNN una nueva mirada a la histología de cada paciente y captura la heterogeneidad dentro del ROI. Cada HPF se procesa utilizando técnicas estándar de aumento de datos que transforman aleatoriamente el campo para reforzar la robustez de la red a la orientación del tejido y las variaciones en la tinción (33). El SCNN se entrena utilizando múltiples HPF transformados para cada paciente (uno para cada ROI) para tener más en cuenta la heterogeneidad intratumoral entre los ROI. Para la predicción prospectiva, primero tomamos muestras de múltiples HPF dentro de cada ROI para generar una colección representativa de campos para el paciente. El riesgo mediano se calcula dentro de cada ROI y, luego, estos riesgos medianos se clasifican y filtran para predecir un riesgo robusto a nivel de paciente que refleja la agresividad de su enfermedad mientras rechaza cualquier predicción de riesgo atípico. Estos procedimientos de muestreo y filtrado se describen en detalle en Métodos.

SCNN utiliza muestreo y filtrado de imágenes para mejorar la solidez del entrenamiento y la predicción. (A) Durante el entrenamiento, se toma una muestra de un solo HPF de 256 × 256 píxeles de cada región, lo que produce múltiples HPF por paciente. Cada HPF se somete a una serie de transformaciones aleatorias y luego se utiliza como una muestra independiente para actualizar los pesos de la red. Los nuevos HPF se muestrean en cada época de entrenamiento (una pasada de entrenamiento para todos los pacientes). (B) Al predecir el resultado de un paciente recién diagnosticado, se toman muestras de nueve HPF de cada ROI y se predice un riesgo para cada campo. El riesgo mediano de HPF se calcula en cada región, luego se clasifican estos riesgos medianos y se selecciona el segundo valor más alto como riesgo del paciente. Este marco de muestreo y filtrado se diseñó para tratar la heterogeneidad de los tejidos emulando la evaluación histológica manual, donde el pronóstico se basa típicamente en la región más maligna observada dentro de una muestra heterogénea. Las predicciones basadas en el riesgo más alto y el segundo riesgo más alto tuvieron el mismo rendimiento en promedio en nuestros experimentos, pero el riesgo máximo produjo algunos valores atípicos con poca precisión de predicción.

Evaluación de la precisión pronóstica de SCNN.

Para evaluar la precisión pronóstica de SCNN, reunimos cortes de tejido de imagen de portaobjetos completos a partir de muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina y el seguimiento clínico de 769 gliomas del TCGA (conjunto de datos S1). Este conjunto de datos comprende gliomas de grado inferior (grados II y III de la OMS) y glioblastomas (grado IV de la OMS), contiene astrocitomas y oligodendrogliomas, y tiene una supervivencia general que varía de menos de 1 a 14 años o más. En la Tabla S1 se presenta un resumen de la demografía, los grados, la supervivencia y los subtipos moleculares de esta cohorte. El archivo digital de diapositivas se utilizó para identificar las ROI en 1.061 imágenes de diapositivas completas teñidas con H & ampE de estos tumores.

La precisión del pronóstico de los modelos SCNN se evaluó mediante la validación cruzada de Monte Carlo. Dividimos aleatoriamente nuestra cohorte en conjuntos de entrenamiento emparejados (80%) y de prueba (20%) para generar 15 pares de conjuntos de entrenamiento / prueba. Entrenamos un modelo SCNN usando cada conjunto de entrenamiento y luego, evaluamos la precisión pronóstica de estos modelos en los conjuntos de pruebas emparejados, generando un total de 15 mediciones de precisión (Métodos y conjunto de datos S1). La precisión se midió mediante el índice c de Harrell, una estadística no paramétrica que mide la concordancia entre los riesgos previstos y la supervivencia real (36). Un índice c de 1 indica una concordancia perfecta entre el riesgo previsto y la supervivencia global, y un índice c de 0,5 corresponde a una concordancia aleatoria.

A modo de comparación, también evaluamos la precisión pronóstica de los modelos de Cox lineales basales generados utilizando los biomarcadores genómicos y los grados histológicos manuales de la clasificación de gliomas de la OMS (Fig.3A). La OMS asigna los gliomas difusos a tres subtipos genómicos definidos por mutaciones en la isocitrato deshidrogenasa (IDH) genes (IDH1/IDH2) y codeleción de los cromosomas 1p y 19q. Dentro de estos subtipos moleculares, a los gliomas se les asigna además un grado histológico según criterios que varían según la célula de origen (astrocítica u oligodendroglial). Estos criterios incluyen la actividad mitótica, la atipia nuclear, la presencia de necrosis y las características de las estructuras microvasculares (proliferación microvascular). El grado histológico sigue siendo un factor determinante importante en la planificación del tratamiento de los gliomas, y los grados III y IV suelen tratarse de forma agresiva con radiación y quimioterapia concomitante.

Criterios de pronóstico de los gliomas difusos. (A) El pronóstico en los gliomas difusos se determina mediante la clasificación genómica y la clasificación histológica manual.Los gliomas difusos se clasifican primero en uno de los tres subtipos moleculares según IDH1/IDH2 mutaciones y codeleción de los cromosomas 1p y 19q. Luego se determina el grado dentro de cada subtipo utilizando características histológicas. Los subtipos con un linaje astrocítico se dividen por IDH estado de mutación, y la combinación de codeleción 1p / 19q y IDH la mutación define un oligodendroglioma. Estos linajes tienen diferencias histológicas; sin embargo, la evaluación histológica no es un predictor confiable del subtipo molecular (37). Los criterios histológicos utilizados para la clasificación varían desde la morfología nuclear hasta patrones de nivel superior, como la necrosis o la presencia de estructuras microvasculares anormales. (B) Comparación de la precisión pronóstica de los modelos SCNN con la de los modelos basales basados ​​en subtipo molecular o subtipo molecular y grado histológico. Los modelos se evaluaron en 15 conjuntos independientes de entrenamiento / prueba con asignaciones de pacientes aleatorias y con / sin entrenamiento y muestreo de prueba. (C) Los riesgos predichos por los modelos SCNN se correlacionan tanto con el grado histológico como con el subtipo molecular, disminuyendo con el grado y generalmente con tendencia a la agresividad clínica de los subtipos genómicos. (D) Gráficos de Kaplan-Meier que comparan la clasificación histológica manual y las predicciones de SCNN. Las categorías de riesgo (bajo, intermedio, alto) se generaron mediante el umbral de los riesgos de SCNN. N / A, no aplica.

Los modelos SCNN mostraron un poder pronóstico sustancial, logrando un índice c mediano de 0,754 (Fig.3B). Los modelos SCNN también se desempeñaron de manera comparable con los modelos de línea de base de grado histológico manuales (índice c mediano 0,745, PAG = 0.307) y con modelos de base de subtipo molecular (mediana c índice 0.746, PAG = 4,68e-2). Los modelos de referencia que representan la clasificación de la OMS que integran tanto el subtipo molecular como el grado histológico manual funcionaron ligeramente mejor que el SCNN, con una mediana del índice c de 0,774 (rango con signo de Wilcoxon PAG = 2,61e-3).

También evaluamos el impacto de los procedimientos de muestreo y clasificación que se muestran en la Figura 2 para mejorar el rendimiento de los modelos SCNN. La repetición de los experimentos SCNN sin estas técnicas de muestreo redujo el índice c mediano de los modelos SCNN a 0,696, significativamente peor que para los modelos en los que se utilizó muestreo (PAG = 6,55e-4).

Las predicciones de SCNN se correlacionan con los subtipos moleculares y el grado histológico manual.

Para investigar más a fondo la relación entre las predicciones de SCNN y el paradigma de la OMS, visualizamos cómo los riesgos predichos por SCNN se distribuyen entre el subtipo molecular y el grado histológico (Fig.3C). Las predicciones de SCNN estaban altamente correlacionadas con el subtipo molecular y el grado y eran consistentes con los resultados esperados de los pacientes. Primero, dentro de cada subtipo molecular, los riesgos predichos por SCNN aumentan con el grado histológico. En segundo lugar, los riesgos pronosticados son consistentes con las supervivencias generales esperadas publicadas asociadas con los subtipos moleculares (37). IDH Los astrocitomas WT son, en su mayor parte, muy agresivos, con una mediana de supervivencia de 18 meses, y los riesgos colectivos previstos para estos pacientes son más altos que para los pacientes de otros subtipos. IDH Los astrocitomas mutantes son otro subtipo con una supervivencia general considerablemente mejor que varía de 3 a 8 años, y los riesgos previstos para los pacientes de este subtipo son más moderados. En particular, los riesgos de SCNN para IDH Los astrocitomas mutantes no están bien separados para los grados II y III, de acuerdo con los informes de que el grado histológico es un predictor inadecuado del resultado en este subtipo (38). Gliomas infiltrantes con la combinación de IDH Las mutaciones y la codeleción de los cromosomas 1p / 19q se clasifican como oligodendrogliomas en el esquema actual de la OMS, y estos tienen los riesgos pronosticados generales más bajos que concuerdan con las supervivencias generales de más de 10 años (37, 39). Finalmente, notamos una diferencia significativa en los riesgos pronosticados al comparar los IDH mutante y IDH Astrocitomas WT grado III (suma de rango PAG = 6,56e-20). Estos subtipos comparten un linaje astrocítico y se clasifican utilizando criterios histológicos idénticos. Aunque algunas características histológicas son más prevalentes en IDH- astrocitomas mutantes, estas características no son muy específicas o sensibles a IDH tumores mutantes y no se puede utilizar para predecir de forma fiable el estado de la mutación de IDH (40). Los riesgos predichos por SCNN son consistentes con peores resultados para IDH Astrocitomas WT en este caso (mediana de supervivencia 1,7 frente a 6,3 años en el IDH homólogos mutantes), lo que sugiere que los modelos SCNN pueden detectar diferencias histológicas asociadas con IDH mutaciones en astrocitomas.

También realizamos un análisis de Kaplan-Meier para comparar la clasificación histológica manual con las “calificaciones digitales” basadas en las predicciones de riesgo de SCNN (Fig. 3D). Las categorías de riesgo bajo, intermedio y alto se establecieron estableciendo umbrales en las predicciones de SCNN para reflejar las proporciones de grados histológicos manuales en cada subtipo molecular (Métodos). Observamos que, dentro de cada subtipo, las diferencias en la supervivencia capturadas por las categorías de riesgo de SCNN son muy similares a la clasificación histológica manual. Las categorías de riesgo de SCNN y los grados histológicos manuales tienen un poder pronóstico similar en IDH Astrocitomas WT (rango logarítmico PAG = 1,23e-12 vs. PAG = 7.56e-11, respectivamente). En IDH Los astrocitomas mutantes, tanto las categorías de riesgo de SCNN como los grados histológicos manuales, tienen dificultades para separar las curvas de Kaplan-Meier para los grados II y III, pero ambos distinguen claramente el grado IV como asociado con peores resultados. La discriminación para la supervivencia del oligodendroglioma también es similar entre las categorías de riesgo de SCNN y los grados histológicos manuales (log rank PAG = 9,73e-7 vs. PAG = 8,63e-4, respectivamente).

Mejora de la precisión del pronóstico mediante la integración de biomarcadores genómicos.

Para integrar datos tanto histológicos como genómicos en un único marco de predicción unificado, desarrollamos una red neuronal convolucional de supervivencia genómica (modelo GSCNN). El GSCNN aprende de la genómica y la histología simultáneamente mediante la incorporación de datos genómicos en las capas completamente conectadas del SCNN (Fig. 4). Ambos datos se presentan a la red durante el entrenamiento, lo que permite que las variables genómicas influyan en los patrones aprendidos por el SCNN al proporcionar información de subtipos moleculares.

Los modelos GSCNN integran datos genómicos y de imágenes para mejorar el rendimiento. (A) Se desarrolló una arquitectura híbrida para combinar imágenes de histología y datos genómicos para realizar predicciones integradas de la supervivencia del paciente. Estos modelos incorporan variables genómicas como entradas a sus capas completamente conectadas. Aquí, mostramos la incorporación de variables genómicas para gliomas, sin embargo, cualquier número de medidas genómicas o proteómicas se puede utilizar de manera similar. (B) Los modelos GSCNN superan significativamente a los modelos SCNN, así como al paradigma de la OMS basado en el subtipo genómico y la clasificación histológica.

Repetimos nuestros experimentos utilizando modelos GSCNN con imágenes histológicas, IDH estado de mutación y codeleción 1p / 19q como entradas y encontró que el índice c mediano mejoró de 0,754 a 0,801. La adición de variables genómicas mejoró el rendimiento en un 5% en promedio, y los modelos GSCNN superan significativamente al modelo de grado de subtipo de la OMS de referencia entrenado con datos equivalentes (rango con signo PAG = 1,06e-2). Para evaluar el valor de integrar variables genómicas directamente en la red durante el entrenamiento, comparamos GSCNN con un enfoque de integración más superficial, donde primero se entrenó un modelo SCNN usando imágenes de histología, y luego, los riesgos de este modelo se combinaron con IDH y variables 1p / 19q en un modelo de Cox simple de tres variables (Fig. S2). El procesamiento de variables genómicas en las capas completamente conectadas e incluirlas en el entrenamiento proporcionó un beneficio estadísticamente significativo.Los modelos entrenados con el enfoque superficial tuvieron un desempeño peor que los modelos GSCNN con una mediana del índice c que disminuyó a 0,785 (rango con signo PAG = 4,68e-2).

Para evaluar el poder pronóstico independiente de los riesgos predichos por SCNN y GSCNN, realizamos un análisis de regresión de Cox multivariable (Tabla 1). En una regresión multivariable que incluyó riesgos de SCNN, subtipo, grado, edad y sexo, los riesgos de SCNN tenían una razón de riesgo de 3,05 y eran pronósticos al corregir todas las demás características, incluido el grado manual y el subtipo molecular (PAG = 2,71e-12). El subtipo molecular también fue significativo en el modelo de regresión multivariable SCNN, pero el grado histológico no lo fue. También realizamos una regresión multivariable con riesgos de GSCNN y encontramos que GSCNN era significativa (PAG = 9,69e-12) con un índice de riesgo de 8,83. En el modelo de regresión multivariable GSCNN, el subtipo molecular no fue significativo, pero el grado histológico fue marginalmente significativo. También utilizamos el análisis de Kaplan-Meier para comparar las categorías de riesgo generadas a partir de SCNN y GSCNN (Fig. S3). Las curvas de supervivencia para SCNN y GSCNN fueron muy similares cuando se evaluaron en toda la cohorte. Por el contrario, sus habilidades para discriminar la supervivencia dentro de los subtipos moleculares fueron notablemente diferentes.

Razones de riesgo para modelos de regresión de Cox de una o varias variables

Visualización de patrones histológicos asociados con el pronóstico.

Las redes de aprendizaje profundo a menudo son criticadas por ser enfoques de caja negra que no revelan información sobre sus mecanismos de predicción. Para investigar los patrones visuales que los modelos SCNN asocian con resultados deficientes, usamos visualizaciones de mapas de calor para mostrar los riesgos predichos por nuestra red en diferentes regiones de imágenes de diapositivas completas. Las superposiciones de mapas de calor transparentes se utilizan con frecuencia para la visualización en patología digital, y en nuestro estudio, estas superposiciones permiten a los patólogos correlacionar las predicciones de modelos de supervivencia de alta precisión con la histología subyacente en la extensión de una imagen de diapositiva completa. Los mapas de calor se generaron utilizando un modelo SCNN entrenado para predecir el riesgo de cada HPF no superpuesto en una imagen de diapositiva completa. Los riesgos predichos se utilizaron para generar una superposición transparente codificada por colores, donde el rojo y el azul indican un riesgo de SCNN más alto y más bajo, respectivamente.

En la figura 5 se presenta una selección de mapas de calor de riesgo de tres pacientes, con incrustaciones que muestran cómo los SCNN asocian el riesgo con fenómenos patológicos importantes. Para TCGA-DB-5273 (grado III de la OMS, IDH astrocitoma mutante), el mapa de calor del SCNN destaca de manera clara y específica las regiones de proliferación microvascular temprana, una forma avanzada de angiogénesis que es un sello distintivo de la progresión maligna, como asociada con alto riesgo. El riesgo en este mapa de calor también aumenta con la celularidad, la heterogeneidad en la forma y el tamaño nucleares (pleomorfismo) y la presencia de estructuras microvasculares anormales. Las regiones en TCGA-S9-A7J0 tienen grados variables de infiltración tumoral que van desde el cerebro normal hasta regiones normales adyacentes escasamente infiltradas que exhiben satelitosis (donde las células neoplásicas se agrupan alrededor de las neuronas) hasta regiones moderadamente y altamente infiltradas. Este mapa de calor asocia correctamente los riesgos más bajos con las regiones cerebrales normales y puede distinguir el cerebro normal de las regiones adyacentes que están escasamente infiltradas. Curiosamente, los riesgos más altos se asignan a regiones escasamente infiltradas (región 1, Cima) que a las regiones que contienen relativamente más infiltración tumoral (región 2, Cima). Observamos un patrón similar en TCGA-TM-A84G, donde las regiones edematosas (región 1, Fondo) adyacentes a regiones tumorales moderadamente celulares (región 1, Cima) también se les asignan mayores riesgos. Estos últimos ejemplos proporcionan características de riesgo incrustadas en secciones histológicas que no se han reconocido previamente y podrían informar y mejorar la práctica patológica.

Visualización de riesgos con mapas de calor SCNN de diapositiva completa. Realizamos predicciones de SCNN exhaustivamente dentro de imágenes de diapositivas completas para generar superposiciones de mapas de calor de los riesgos que SCNN asocia con diferentes patrones histológicos. El rojo indica un riesgo relativamente mayor y el azul indica un riesgo menor (la escala para cada diapositiva es diferente). (Cima) En TCGA-DB-5273, SCNN predice clara y específicamente altos riesgos para las regiones de proliferación microvascular temprana (región 1) y también, mayores riesgos con el aumento de la infiltración tumoral y la densidad celular (región 2 frente a 3). (Medio) En TCGA-S9-A7J0, SCNN puede discriminar adecuadamente entre la corteza normal (región 1 en Fondo) y regiones adyacentes infiltradas por tumor (región 1 en Cima). A las regiones altamente celulares que contienen estructuras microvasculares prominentes (región 3) se les asignan nuevamente riesgos más altos que a las regiones tumorales de menor densidad (región 2). Curiosamente, el infiltrado de baja densidad en la corteza se asoció con alto riesgo (región 1 en Cima). (Fondo) En TCGA-TM-A84G, SCNN asigna altos riesgos a las regiones edematosas (región 1 en Fondo) que son adyacentes al tumor (región 1 en Cima).


Soluciones de microscopía para histología e histopatología

La patología, histopatología o histología tiene como objetivo estudiar la manifestación de la enfermedad mediante el examen microscópico de la morfología de los tejidos. En patología, la muestra que se examinará bajo el microscopio suele ser el resultado de una cirugía, biopsia o autopsia después de la fijación, limpieza / inclusión y sección de la muestra de tejido. Alternativamente, el procesamiento de la sección congelada con un criostato se realiza cuando se requieren resultados rápidos (por ejemplo, durante la cirugía) o la fijación sería perjudicial para las estructuras diana como los lípidos o ciertos antígenos. Las secciones de tejido después de la fijación y la inclusión de cera se cortan típicamente en rodajas finas de dos a cinco micrones con un micrótomo antes de teñir y se transfieren a un portaobjetos de vidrio para su examen con un microscopio óptico. Las muestras típicas en patología son colon, riñón, páncreas, cuello uterino, pulmón, mama, próstata o tejido conectivo.

Si bien ya en el siglo XVII se han desarrollado varios procedimientos de tinción para tejidos humanos / animales y vegetales, el médico alemán Rudolf Virchow es considerado el padre de la histopatología moderna. Virchow se dio cuenta del potencial de las nuevas técnicas microscópicas emergentes del siglo XIX para su investigación pionera, publicó una gran cantidad de escritos científicos y creó una colección impresionante de miles de portaobjetos de muestras histopatológicas, lo que sentó las bases de la histología moderna y la investigación del cáncer.

La preparación del portaobjetos de histología comienza con la fijación de la muestra de tejido. Este es un paso crucial en la preparación del tejido y su propósito es prevenir la autólisis y putrefacción del tejido. Para obtener los mejores resultados, las muestras de tejido biológico deben transferirse al fijador inmediatamente después de la recolección, generalmente en formalina tamponada neutra al 10% durante 24 a 48 horas. Después de la fijación, las muestras se recortan con un bisturí para que quepan en un casete de tejido debidamente etiquetado que se almacena en formalina hasta que comienza el procesamiento.

El primer paso del procesamiento es la deshidratación, que implica sumergir la muestra en concentraciones crecientes de alcohol para eliminar el agua y la formalina del tejido. El aclarado es el siguiente paso, en el que se utiliza un disolvente orgánico como el xileno para eliminar el alcohol y permitir la infiltración con cera de parafina. La incrustación es el paso final, donde las muestras se infiltran con el agente de incrustación, generalmente cera de parafina, que proporciona una matriz de soporte que permite cortes muy finos. Se utiliza un micrótomo para cortar secciones de tejido extremadamente delgadas del bloque en forma de cinta, después de la tinción histoquímica (típicamente hematoxilina y eosina - "tinción HE") para proporcionar contraste a las secciones de tejido, haciendo que las estructuras de tejido sean más visibles y más fáciles de evaluar. . En ciertos casos, se requieren tinciones inmunohistoquímicas (IHC), como HER2 o Ki-67, para un análisis adicional.


Análisis de imágenes digitales en diapositivas de pulmón completo en modelos de ratón con neumonía aguda

La histopatología descriptiva de modelos de ratón de neumonía es esencial para evaluar el resultado de infecciones, manipulaciones moleculares o terapias en el contexto de pulmones completos. Las comparaciones cuantitativas entre grupos experimentales, sin embargo, se han limitado a laboriosas estereologías o sistemas de puntuación mal definidos que dependen de la subjetividad de un observador más o menos experimentado. Aquí, presentamos análisis de imágenes digitales de autoaprendizaje que nos permiten transformar la información óptica de secciones completas del pulmón del ratón en datos estadísticamente comprobables. Se adoptó un software basado en el reconocimiento de patrones y un algoritmo de recuento nuclear para cuantificar patologías definidas por el usuario a partir de escaneos completos de diapositivas de pulmones infectados con steotococos neumonia o el virus de la influenza A en comparación con los pulmones expuestos a PBS. Los parámetros de lectura “área relativa afectada” y “recuentos nucleares por área” se proponen como criterios relevantes para la cuantificación de lesiones de secciones teñidas con hematoxilina y eosina, permitiendo también la generación de un mapa de calor de, por ejemplo, infiltrados de células inmunes con asignaciones anatómicas en secciones enteras del pulmón. Además, cuando se combinan con el etiquetado inmunohistoquímico de proteínas marcadoras, ambos enfoques son útiles para la identificación y el recuento de, por ejemplo, poblaciones de células inmunitarias, como se valida aquí mediante comparaciones directas con datos de citometría de flujo. Las soluciones se pueden ajustar de forma fácil y flexible a las especificidades de diferentes modelos o patógenos. Los análisis digitales automatizados de secciones completas de pulmón de ratón pueden establecer un nuevo estándar para la cuantificación comparativa de alto rendimiento definida por el usuario de imágenes histológicas e inmunohistoquímicas. Aún así, nuestros algoritmos establecidos aquí son solo un comienzo y deben probarse en estudios adicionales y otras aplicaciones en el futuro.

Durante muchas décadas, la histopatología morfológica clásica ha servido como una herramienta de lectura esencial para la evaluación de lesiones tisulares e infiltraciones de células inmunitarias en experimentos de infección pulmonar en animales (p. Ej., En la evaluación de los efectos del tratamiento o en el descubrimiento de vías de señalización molecular). Por ejemplo, varios patrones de lesión histológica definidos se consideran características de diagnóstico principales en la evaluación de la lesión pulmonar aguda experimental en ratones (1). Para capitalizar aún más esta información principalmente descriptiva, se han establecido sistemas de puntuación para permitir una primera evaluación semicuantitativa de patologías inducidas experimentalmente y una comparación aproximada con los controles (1, 2). En el pulmón, estos sistemas de puntuación suelen incluir varios parámetros que reflejan las lesiones tisulares características y las infiltraciones celulares que se semicuantifican mediante estimaciones subjetivas y la clasificación de la distribución y la gravedad de las lesiones (3). Para agregar un enfoque más cuantitativo, los parámetros de puntuación única se pueden cuantificar mediante el recuento manual o la medición de eventos seleccionados o áreas representativas. Sin embargo, estos enfoques requieren mucho tiempo, son imprecisos e inherentemente subjetivos y, por lo tanto, problemáticos para el análisis de grandes conjuntos de datos o la detección confiable de pequeñas diferencias entre grupos (4, 5).Claramente, un enfoque más preciso, reproducible y más sensible pero práctico para la cuantificación de áreas de lesión o eventos susceptibles de estudios de alto rendimiento sería deseable para la recolección, análisis, interpretación y comunicación de resultados histopatológicos, particularmente para comparaciones directas entre grupos experimentales o con datos bioquímicos o moleculares (6). Hoy en día, la estereología se considera el estándar de oro para la estimación absoluta de puntos finales numéricos, como el número de células, superficies o volúmenes. Sin embargo, se aplican varias limitaciones a la estereología, incluidos los altos costos y los gastos de tiempo, así como la falta general de usabilidad para el material de archivo en estudios retrospectivos (5).

Los desarrollos recientes en imágenes digitales de portaobjetos completos ofrecen un potencial prometedor en la optimización y un examen más computarizado de muestras histopatológicas, incluido el examen retrospectivo de muestras no incluidas de forma aleatoria (7, 8). Esta tecnología de escaneo de portaobjetos completo (WSS) permite escanear ópticamente un portaobjetos histológico completo en un archivo de datos de imagen binaria, que puede visualizarse, evaluarse y procesarse en una pantalla de computadora sin un microscopio (8, 9). Además, las herramientas de análisis de imágenes digitales morfométricas (DIA) bidimensionales (2D) de rápido desarrollo aceleran y simplifican la conversión precisa de datos histopatológicos descriptivos o semicuantitativos en datos numéricos susceptibles de pruebas estadísticas (7, 10).

El software de análisis de imágenes de reconocimiento de patrones asistido por computadora ofrece una nueva dimensión en la identificación y cuantificación automatizada y de autoaprendizaje de regiones de interés dentro de imágenes histológicas digitalizadas (11). Específicamente en la neumonía, las áreas de inflamación distribuidas de manera no homogénea caracterizadas por varios parámetros, como infiltración de células inmunes, edema, cambios estructurales, como colapso o enfisema, o áreas de necrosis, podrían considerarse regiones de interés potenciales. El software de análisis de imágenes de reconocimiento de patrones de autoaprendizaje, GENIE, fue diseñado para análisis de alto rendimiento, lo que permite la investigación de grandes lotes de histoslides escaneados digitalmente en un período de tiempo práctico (7, 10). Un segundo desarrollo reciente en el análisis computarizado de histoslides escaneados, denominado "cuantificación de células completas", permite la identificación y enumeración de un amplio espectro de patrones o eventos histológicos, como células o núcleos teñidos con hematoxilina y eosina (H & ampE) o señales inmunohistoquímicas (9). Sin embargo, en lugar de producir estimaciones absolutas obtenidas por estereología (12, 13), tales cuantificaciones de patrones y eventos en secciones de tejido 2D son particularmente adecuadas para la generación de proporciones o densidades, como el número de células por estructura anatómica definida o milímetro cuadrado.

Hasta la fecha, tales desarrollos en DIA automatizado, específicamente el GENIE y los sistemas de software de cuantificación de células completas, solo se han utilizado esporádicamente para el examen de pulmones de ratón, como en oncología (14), pero no en neumonía experimental. Aquí, presentamos el algoritmo GENIE basado en reconocimiento de patrones y el algoritmo de conteo nuclear v9 (v9 nc) para la cuantificación morfométrica relativa de información óptica bidimensional obtenida por escaneo digital de secciones teñidas con H & ampE de órganos completos de pulmones desafiados con PBS o pulmones infectados con steotococos neumonia o virus de la influenza A (IAV). En nuestras comparaciones con los datos obtenidos por citometría de flujo (FC), el algoritmo de recuento nuclear también resultó operativo para la cuantificación relativa de subtipos de células inmunes marcadas inmunohistoquímicamente, ampliando su aplicabilidad al nivel de en el lugar cuantificación de marcadores moleculares de enfermedad.

Los detalles sobre ratones, procedimientos de infección, procesamiento, histología, inmunohistoquímica (IHC), FC y análisis de imágenes digitales se encuentran en los métodos en el suplemento de datos.

Todos los tejidos pulmonares se derivaron de experimentos realizados principalmente con fines distintos a este estudio y publicados en otros lugares (15-18). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por los comités de ética institucionales de Charité-Universitätsmedizin Berlin, Justus-Liebig University, Gießen, University Hospital of Jena y autoridades gubernamentales locales (LaGeSo Berlin, RP-Gießen, TLV-Thüringen ID de aprobación: A-0050/15 , G 0139/14, 02-067 / 11, 02-043 / 15 [S. pneumoniae], G 0358/11 [PBS], G 0044/11 [IAV]). Los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y recomendaciones de la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencias de los Animales de Laboratorio para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el malestar y el sufrimiento de los animales.

Ratones infectados con 5 × 10 6 ufc S. pneumoniae PN36 (serotipo 3) -, 5 × 10 7 ufc S. pneumoniae D39 (serotipo 2) -, o 100 pfu virus de la influenza PR8 - y ratones desafiados con PBS fueron sacrificados humanitariamente a las 24 o 48 horas (S. pneumoniae, PBS) o 7 días (IAV), como se describió anteriormente (15-19). Los pulmones se extrajeron cuidadosamente después de la ligadura traqueal para evitar el colapso alveolar, se fijaron por inmersión en formalina pH 7,0 durante 24 a 48 horas, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 2 μm.

Secciones de pulmón completo (norte = 4-8 ratones por grupo) se tiñeron con H & ampE o se procesaron para IHC. Para la detección de CD68 (macrófagos / monocitos), se utilizaron elastasa de neutrófilos (neutrófilos), CD3 (linfocitos T) o CD45R (linfocitos B), anticuerpos policlonales de conejo o un anticuerpo monoclonal de rata, respectivamente. Los portaobjetos de IHC se tiñeron con hemalaun. Todos los portaobjetos se deshidrataron a través de etanoles graduados, se aclararon con xileno y se cubrieron con cubreobjetos.

Se aislaron leucocitos de pulmón y se tiñeron con anti-CD11c (N418 ATCC), anti-CD11b (M1 / 70 eBioscience), anti-F4 / 80 (BM8 eBioscience), anti-Ly6G (1A8 BD), anti-CD3 (17A2 eBioscience) , anticuerpos anti-CD4 (RM4–5 BD), anti-B220 (RA3–6B2 eBioscience) y anti-CD19 (1D3 BD). Todas las células teñidas se adquirieron usando un BD FACS Canto II. Las células se analizaron con el software BD FACSDiva.

Los portaobjetos teñidos se digitalizaron automáticamente (norte = 4 a 8 por grupo) utilizando el escáner Aperio CS2 (Leica Biosystems Imaging Inc.) a 400 aumentos (resolución de 0,25 μm / píxel). Para el reconocimiento de patrones de tejido pulmonar afectado versus no afectado, se utilizó el software de reconocimiento de patrones histológicos Aperio GENIE (Leica Biosystems Imaging Inc.). Las áreas representativas de cada clase de tejido de interés (Tabla 1) fueron identificadas por un patólogo veterinario experimental capacitado en base a las características histológicas, y compiladas en un montaje digital con un aumento de 100 × para establecer un clasificador GENIE. Este clasificador se entrenó en varios portaobjetos pulmonares de un lote para distinguir las áreas afectadas de las no afectadas, el fondo y el vidrio, lo que permite la caracterización y adaptación específicas del modelo (Tabla 1). Se empleó el algoritmo Aperio v9 nc para la cuantificación del número total de núcleos o células teñidas con hemalaun o por IHC con configuraciones específicas para cada tinción y antígeno utilizado (ver Tabla E1 en el suplemento de datos).

Tabla 1. Definición de clases de tejidos en los modelos analizados

Los datos se expresan como media (± SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional / prueba de comparación múltiple de Sidak y ANOVA bidireccional / prueba de comparación múltiple de Turquía. PAG los valores inferiores a 0,05 se consideraron significativos (GraphPad PRISM 7 Graph Pad Software Inc.).

Uno de los parámetros de lectura cuantitativa más utilizados en histología pulmonar es la estimación del área de tejido afectado (16, 17). Sin embargo, tanto las estimaciones subjetivas como las mediciones simples que utilizan tamaños máximos en dos dimensiones son obviamente propensas a dar como resultado datos imprecisos, con reproducibilidad limitada cuando las realiza un ser humano. Aquí, diapositivas horizontales de pulmón entero de planos consecutivos de S. pneumoniae–Los pulmones infectados fueron digitalizados por un escáner de histoslide de patología para crear un archivo de datos de imagen que se puede usar para DIA adicional (Figura 1A, por ejemplo, usando la herramienta GENIE). El establecimiento de un nuevo algoritmo GENIE comienza con la definición de diferentes clases de lesiones, incluido el tejido pulmonar afectado (Figura 1B, panel izquierdo, etiquetado en rojo), tejido pulmonar no afectado (Figura 1B, panel central, etiquetado en verde), fondo (Figura 1B, panel derecho, etiquetado en gris) y solo vidrio (Figura 1B, panel derecho, etiquetado en beige). El software ofrece diferentes modalidades de anotaciones, como formas rectangulares o circulares o una herramienta a mano alzada. Para ello, se creó un montaje (Figura 1C) que incluía las cuatro clases de tejido caracterizadas diferencialmente (Tabla 1) que posteriormente serían identificadas automáticamente por el software (Figura 1C), seguido de una cuantificación precisa. El algoritmo GENIE extrae predominantemente información multiespectral de imágenes con procesamiento de imágenes adicional realizado por operadores espaciales, lógicos y de umbral. El algoritmo GENIE específico se refinó durante el aprendizaje computacional evolutivo mediante un proceso de aprendizaje iterativo, utilizando un mínimo de 500 iteraciones, para identificar las características espaciales-espectrales únicas para la discriminación de cada clase de tejido objetivo. Se predefinió como suficiente una precisión media final del entrenamiento del 95% o más. El algoritmo final, denominado "clasificador" en el software GENIE, se aplicó a los escáneres de portaobjetos de todo el pulmón (Figura 1D) después de la anotación manual (línea verde) para excluir los tejidos no pulmonares, como los tejidos adiposo y linfoide. Las cuatro clases especificadas se identificaron con precisión en todas las secciones de pulmón (Figuras 1D y 1E) por el clasificador GENIE específico, como esperaban los patólogos certificados por la junta (Figura 1F). Cada clasificador GENIE se generó por separado para cada modelo de infección a fin de capturar sus características únicas y específicas de patógenos.

Figura 1. Análisis de imágenes digitales (DIA): recuento nuclear GENIE y v9 (v9 nc). (AF) DIA de steotococos neumonia–Pulmones infectados utilizando el algoritmo GENIE. (A) Los pulmones se visualizaron mediante tecnología de escaneo de portaobjetos completo (WSS). (B) La determinación de diferentes clases de tejido pulmonar mediante la creación de un conjunto de entrenamiento dio como resultado un montaje (C), que permite diferenciar entre afectados (B, panel izquierdo, rojo) y no afectado (B, panel central, verde) áreas pulmonares, fondo (B, panel derecho, gris) y vidrio (B, panel derecho, beige). (D) Después de la anotación manual de los pulmones (línea verde) y en base al conjunto de entrenamiento y montaje previamente generados, se generó el clasificador GENIE para la discriminación de áreas pulmonares afectadas y no afectadas. (mi) Todas las clases definidas, como las áreas de inflamación (p. Ej., Caracterizadas por la infiltración de células inmunitarias en la punta de flecha de los espacios alveolares), se identificaron con precisión mediante el algoritmo GENIE recién generado. (GRAMOI) DIA de S. pneumoniae–Pulmones infectados utilizando el algoritmo v9 nc. (GRAMO) Después de la anotación manual de los pulmones (línea verde), se aplicó el algoritmo v9 adaptado y modificado para la cuantificación de núcleos en las exploraciones de pulmón completo. (H y I) El número total de núcleos teñidos con hemalaun se cuantificó con precisión (recuadros, punta de flecha) y de forma fiable. Barra de escala (A): 1 mm, también válido para D y GRAMO barra de escalami): 100 μm, válido también para F barras de escalaB y H): 50 μm, válido también para I y barra de escala (inserciones en H): 10 μm, también se aplica a insertos en I.

La determinación del número total o relativo de células o subconjuntos específicos de células, como los neutrófilos, mediante recuento manual o análisis de FC es un parámetro típico en la evaluación de los resultados de la neumonía experimental (16, 17). Para mejorar aún más las opciones de lectura para los portaobjetos histológicos de modelos de infección pulmonar, el algoritmo v9 nc para la cuantificación de núcleos o células se adaptó aquí para cumplir con las condiciones específicas (Tabla E1) en WSS teñido con H & ampE de S. pneumoniae–Pulmones infectados (Figura 1G). Después de la anotación manual de los tejidos pulmonares (Figura 1G, línea verde), los núcleos teñidos con H & ampE (Figura 1H, recuadro) se cuantificaron mediante el algoritmo modificado (Figura 1I, recuadro).

La cuantificación digital precisa de las áreas pulmonares afectadas, así como el recuento de células o eventos por área en secciones histológicas, podría representar una herramienta poderosa, objetiva, confiable y altamente reproducible pero práctica para la comparación relativa de grupos experimentales (p. Ej., Tratados versus grupos no tratados) o para las evaluaciones de los efectos de modificaciones genéticas de patógenos o huéspedes. WSS de pulmones de ratones de control desafiados con PBS y ratones infectados con S. pneumoniae o IAV (Figura 2A) se compararon usando clasificadores GENIE específicamente modificados para la determinación de áreas pulmonares afectadas y algoritmos v9 nc adaptados específicamente para la enumeración de núcleos totales por área dentro de secciones de pulmón completo (Figura 2A). Cuando las proporciones o densidades, como las células por área, se cuantifican en secciones de tejido 2D que contienen lesiones distribuidas de manera no homogénea, es imperativo igualar los procedimientos de preparación, inclusión y corte para minimizar los artefactos técnicos. Además, la inevitable contracción del tejido durante la inclusión en parafina puede ser una fuente de error en las comparaciones de grupos cuando los artefactos de contracción difieren entre los grupos experimentales (5). Con este fin, se midieron las áreas pulmonares totales de WSS igualmente procesadas antes de los análisis digitales y se compararon entre los grupos experimentales (Figura 2B), asumiendo tamaños iniciales iguales de pulmones de ratones de la misma cepa, edad y sexo. No se registraron diferencias entre las áreas seccionales de todo el pulmón de los ratones infectados con S. pneumoniae (80,13 ± 21,89 mm 2), IAV (75,82 ± 16,20 mm 2) y desafiado con PBS (77,96 ± 14,40 mm 2 Figura 2B). Por el contrario, las áreas del parénquima pulmonar afectado aumentaron significativamente en los ratones infectados en comparación con los controles desafiados con PBS (PBS, 12,80 ± 5,53% S. pneumoniae, 44,53 ± 10,58% IAV, 28,97 ± 4,90% Figura 2C). De manera consistente, el número de núcleos totales por sección completa de pulmón también aumentó significativamente después de S. pneumoniae (750,404 ± 181,110 núcleos) o infección por IAV (541,023 ± 157,223 núcleos) en comparación con pulmones desafiados con PBS (400,395 ± 51,519 núcleos Figura 2D). Se registraron diferencias similares para la densidad general de núcleos por milímetro cuadrado de área pulmonar (PBS, 5282 ± 878 núcleos / mm 2 S. pneumoniae, 10.342 ± 1.163 núcleos / mm 2 e IAV, 7.733 ± 575 núcleos / mm 2 de sección pulmonar (Figura 2E). Es de destacar que los pulmones infectados con S. pneumoniae se vieron significativamente más afectados en comparación con los pulmones infectados con IAV en términos de recuentos de células totales más altos y áreas más grandes afectadas (Figuras 2A, 2C y 2E).

Figura 2. Comparaciones cuantitativas entre modelos de infección pulmonar y reproducibilidad de análisis de imágenes digitales. (A) WSS de pulmones de ratones infectados y desafiados con PBS (steotococos neumonia [Spn] y el virus de la influenza A [IAV]) se compararon en términos de área pulmonar afectada y recuento total de núcleos utilizando los algoritmos GENIE y v9 nuclear count (v9 nc). (B) Se midieron las áreas transversales totales de todos los pulmones antes de los análisis de imágenes digitales. (C) Los porcentajes de áreas pulmonares afectadas, así como (D) se determinaron los núcleos totales por área pulmonar completa y (mi) normalizado al área de la sección transversal para evaluar los núcleos totales por área (mm 2). (F y GRAMO) Se realizaron análisis idénticos de pulmones infectados con dos serotipos diferentes (ST) de neumococos (ST2, D39 ST3, PN36) o controles desafiados con PBS en dos puntos de tiempo diferentes, 24 hy 48 h después de la infección. Los valores se dan como media (± SEM norte = 4–8 por grupo). ## PAG & lt 0.01, ### PAG & lt 0.001, #### PAG & lt 0,0001 versus controles PBS. *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001, ****PAG & lt 0,0001 como se indica usando ANOVA unidireccional / prueba de comparación múltiple de Sidak (B y mi) y ANOVA bidireccional / prueba de comparación múltiple de Turquía (F y GRAMO). Barra de escala (WSS): 1 mm. (H) Todo el procedimiento de cuantificación, incluida la exploración de histoslides, se repitió tres veces utilizando cuatro portaobjetos de pulmón entero afectados de forma diferente por neumonía neumocócica y los algoritmos v9 nc y GENIE. Los valores se dan como media (± SEM norte = 4 muestras con tres repeticiones por muestra).

Se realizaron análisis de imágenes digitales de pulmones infectados con dos serotipos diferentes de neumococos, serotipos 2 y 3, o controles desafiados con PBS en dos puntos de tiempo diferentes, 24 y 48 horas después de la infección, para cuantificar y comparar diferentes severidades de neumonía en una cepa y moda dependiente del tiempo. Los parámetros de gravedad medidos fueron los porcentajes de áreas pulmonares afectadas, así como el número absoluto y relativo de células en los pulmones. De hecho, los datos revelaron un aumento dependiente del tiempo y la tensión en los porcentajes de áreas afectadas (Figura 2F). así como en el número de celdas (Figura 2G). En comparación con los controles de PBS, la cepa PN36 del serotipo 3 indujo áreas de neumonía significativamente más grandes de una manera dependiente del tiempo (24 h, PBS, 9,80 ± 3,69% D39, 18,34 ± 10,38% PN36, 23,97 ± 8,21% 48 h, PBS, 10,36 ± 6,74% D39, 34,23 ± 3,56% PN36, 46,52 ± 9,52% Figura 2F). Se observó un efecto muy similar para el número de células (24 h, PBS, 4.560 ± 378 núcleos / mm 2 D39, 5.779 ± 1.167 núcleos / mm 2 PN36, 7.584 ± 972 núcleos / mm 2 sección pulmonar 48 h, PBS, 5.147 ± 1.205 núcleos / mm 2 D39, 7.574 ± 848 núcleos / mm 2 PN36, 10.186 ± 995 núcleos / mm 2 sección de pulmón Figura 2G). Además, de acuerdo con su conocida menor capacidad de inducir neumonía (20), la cepa D39 del serotipo 2 indujo aumentos más bajos en ambos parámetros que la cepa PN36 a las 24 y 48 horas, nuevamente de manera dependiente del tiempo (Figuras 2F y 2G).

Para examinar la precisión en términos de reproducibilidad de ambas aplicaciones (GENIE y v9nc), todos los procedimientos se repitieron tres veces utilizando cuatro muestras de neumonía neumocócica afectadas de manera diferente como plantillas. Con este fin, los mismos cuatro portaobjetos de pulmón se volvieron a escanear, se volvieron a anotar manualmente y se volvieron a analizar por el v9 nc y el clasificador GENIE tres veces (Figura 2H). La concordancia entre los datos finales obtenidos a lo largo de todo el procedimiento alcanzó medias de 99,70 (± 0,19)% para el algoritmo v9 nc y 99,03 (± 0,63)% para el clasificador GENIE sugiriendo una alta reproducibilidad de los resultados obtenidos por ambas aplicaciones (Figura 2H).

Presumimos que las señales inmunohistoquímicas pueden servir como eventos contables en el algoritmo v9 nc, similar a los núcleos celulares teñidos con hemala. Para el recuento de varios subconjuntos de células inmunes, se realizó IHC en S. pneumoniae–Pulmones infectados usando anticuerpos contra CD68 (macrófagos / monocitos, Figura 3A), elastasa de neutrófilos (neutrófilos Figura 3B), CD3 (células T, Figura 3C) o CD45R (células B Figura 3D). El algoritmo v9 nc se adaptó a cada protocolo de tinción (Tabla E1) y permitió la identificación confiable y el recuento de células marcadas inmunohistoquímicamente (Figuras 3E-3H). Los datos de salida incluyeron el número total y relativo de células positivas por milímetro cuadrado de área pulmonar, así como diferentes intensidades de tinción, aquí definidas como sin teñir (0+), débil (1+), moderado (2+) o fuerte (3+). ) señales, las intensidades nucleares promedio de rojo, verde y azul, los tamaños nucleares promedio en píxeles y milímetros cuadrados, y el área de análisis en píxeles o milímetros cuadrados (Figuras 3E-3H). Comparaciones de poblaciones relativas de células inmunitarias en S. pneumoniae- versus pulmones infectados con IAV revelaron que todos los tipos de células analizados fueron reclutados de manera significativa, pero en su mayoría en oposición, en los dos modelos de infección (Figura 3I). Aunque los neutrófilos representan los leucocitos dominantes en S. pneumoniae infección (S. pneumoniae, 3627 ± 228 células marcadas / mm 2 IAV, 885 ± 126 células marcadas / mm 2), células T (S. pneumoniae, 1,164 ± 282 células marcadas / mm 2 IAV, 2,583 ± 235 células marcadas / mm 2) y macrófagos (S. pneumoniae, 905 ± 93 células marcadas / mm 2 IAV, 1.770 ± 273 células marcadas / mm 2) fueron los tipos de células principales en los pulmones infectados con IAV. Células B (S. pneumoniae, 220 ± 88 células marcadas / mm 2 IAV, 370 ± 66 células marcadas / mm 2) fueron menos reclutadas para S. pneumoniae- y pulmones infectados con IAV en comparación con los controles PBS y representaron el menor número de células inmunes analizadas en ambos modelos de infección (Figura 3I). Las células T predominaron en los controles de PBS (1494 ± 179 células marcadas / mm 2), con números similares en S. pneumoniae–Pulmones infectados, pero números significativamente más altos después de la infección por IAV (Figura 3I). Los macrófagos fueron ligeramente más bajos en número que las células T en los pulmones desafiados con PBS (880 ± 79 células marcadas / mm 2), pero también aumentaron significativamente en los pulmones infectados con IAV. Las células B (725 ± 90 células marcadas / mm 2) como la tercera población común en pulmones desafiados con PBS disminuyeron significativamente después de la infección con ambos patógenos, mientras que el número de neutrófilos (512 ± 233 células marcadas / mm 2) fue significativamente menor en PBS pulmones en comparación con la infección bacteriana, como se esperaba (Figura 3I).

Figura 3. Inmunofenotipado y cuantificación de células y validación por comparación con datos de citometría de flujo (FC). (AD) Tinción inmunohistoquímica de steotococos neumonia–Secciones de pulmón infectadas para la detección de CD68 + (A, macrófagos / monocitos), elastasa de neutrófilos positivo (B, neutrófilos) CD3 + (C, Células T) y CD45R + (D, Células B) células. (miH) DIA de pulmones teñidos inmunohistoquímicamente utilizando el algoritmo adaptado v9 nc para cada antígeno (Tabla E1). Los datos de salida incluyeron varios tipos de información, como el número y la intensidad de las células teñidas (recuadros). (I) Resultados de cuantificación de células marcadas por milímetro cuadrado de área pulmonar en S. pneumoniae- o pulmones infectados con IAV y controles desafiados con PBS. (J y K) Comparación de poblaciones de células inmunes relativas determinadas por análisis DIA y FC en desafiados con PBS (J) y S. pneumoniae–Pulmones infectados (K). Los valores se dan como media (± SEM norte = 4-5 por grupo). #### PAG & lt 0,0001 versus controles PBS. ****PAG & lt 0,0001 como se indica usando ANOVA unidireccional / prueba de comparación múltiple de Sidak. Barra de escala (H): 50 μm, válido también para AGRAMO. Inserto de barra de escala (H): 20 μm, también se aplica a insertos en miGRAMO.

Para la validación de datos obtenidos digitalmente de secciones 2D de pulmón completo, poblaciones de células inmunitarias relativas extraídas de pulmones enteros después de la exposición con PBS o S. pneumoniae La infección fue determinada por FC (Figura E1) y calculada de manera similar para comparación directa con las proporciones obtenidas por DIA. En pulmones desafiados con PBS, números relativos de macrófagos (DIA, 24,05 ± 1,83% FC, 27,58 ± 3,09%), neutrófilos (DIA, 13,40 ± 4,83% FC, 10,50 ± 1,72%), células T (DIA, 40,78 ± 4,13% FC, 31,72 ± 2,29%) y las células B (DIA, 21,77 ± 1,89% FC, 30,20 ± 2,11%) fueron casi similares en ambos métodos (Figura 3J), lo que también fue cierto para el número de macrófagos (DIA, 14,93 ± 1,17% FC, 14,57 ± 1,47%), neutrófilos (DIA, 60,27 ± 7,12% FC, 72,75 ± 1,50%), células T (DIA, 19,02 ± 3,82% FC, 8,83 ± 0,86%) y células B (DIA, 5,79 ± 3,77% FC, 3,85 ± 0,50%) en S. pneumoniae–Pulmones infectados (Figura 3K). De hecho, se observó una alta concordancia para la mayoría de los datos obtenidos por estos dos enfoques (Figuras 3J y 3K), lo que sugiere que los resultados de la DIA 2D pueden, de hecho, ser válidos y, de hecho, parecerse a la situación en pulmones completos.

Los dos enfoques diferentes de reconocimiento de patrones digitales automatizados establecidos aquí permiten la cuantificación de dos aspectos universalmente relevantes de la histopatología de la neumonía en portaobjetos de pulmón completo en 2D, que incluyen el área relativa y absoluta de tejido pulmonar inflamado y el número y densidad de células. Además, el algoritmo v9 nc se utilizó con éxito para cuantificar subconjuntos de células inmunes marcadas inmunohistoquímicamente. Claramente, los parámetros cuantificados aquí son solo un comienzo, y son concebibles muchas otras aplicaciones y parámetros objetivo. El software de reconocimiento de patrones, GENIE, y el algoritmo v9 nc proporcionan herramientas de autoaprendizaje para obtener una cuantificación automatizada de alto rendimiento de lesiones histológicas complejas definidas por el usuario a partir de portaobjetos de vidrio estándar que se utilizan comúnmente para histopatología descriptiva. Con este desarrollo, el análisis de imágenes computarizado en secciones de pulmón completo escaneadas representa avances tanto técnicos como logísticos en la adquisición precisa de datos numéricos y la evaluación estadística de los cambios morfológicos en la neumonía de ratón. Estudios previos sobre cáncer de pulmón y lesión cerebral han demostrado que las cuantificaciones obtenidas por estas tecnologías son más fiables, reproducibles y apropiadas en el tiempo (6, 11, 21, 22) en comparación con la cuantificación manual de parámetros seleccionados. Por lo tanto, además de la histopatología descriptiva estándar, los sistemas de puntuación semicuantitativos y la estereología, la DIA en secciones de órganos completos ahora está disponible para la investigación pulmonar y se puede esperar que amplíe ampliamente las opciones de lectura en los estudios de neumonía en ratones, fortaleciendo aún más el valor de la histología pulmonar ( Figura 4 ).

Figura 4. Opciones analíticas para histopatología de sección de pulmón completo. 2D = bidimensional 3D = tridimensional.

Aquí, aplicamos DIA a modelos de infección pulmonar bacteriana y viral y comparamos los datos con controles desafiados con PBS. Se generaron algoritmos GENIE separados y específicos del modelo para la determinación objetiva y la cuantificación comparativa de las áreas pulmonares afectadas, que, en el pasado, solo podían estimarse aproximadamente en secciones 2D (16, 17). Sin embargo, debido a las amplias discrepancias entre las histopatologías de diferentes modelos de infección y patógenos (3), es necesario establecer algoritmos GENIE específicos para cada modelo o patógeno para capturar el modelo único o las características específicas del patógeno que se van a cuantificar. Los algoritmos específicos del modelo generados aquí identificaron con precisión las clases de tejido anotadas, lo que nos permitió distinguir y cuantificar las áreas pulmonares, el fondo y el vidrio afectados y no afectados. De manera similar, el número de núcleos o células se cuantificó mediante algoritmos v9 nc, lo que permitió la cuantificación precisa tanto de núcleos teñidos con hemala como de señales de marcadores inmunohistoquímicos dentro de núcleos o células.

La alta precisión de ambos sistemas, los algoritmos GENIE y v9 nc, evaluados aquí a través de la reproducibilidad de los resultados en todos los procedimientos, incluido el escaneo de portaobjetos y las exclusiones manuales de tejidos adiposos y linfoides adyacentes, indican una alta confiabilidad de los datos en términos de reflejo de los datos reales. información morfológica en los portaobjetos. Además, cuando comparamos porcentajes de subtipos de células inmunes entre DIA de secciones de tejido 2D de planos pulmonares centrales y datos de FC obtenidos de extractos de pulmón completo, las similitudes generales cercanas implican que los datos relativos, como las proporciones de células medidas en secciones representativas de pulmón completo, puede representar un compromiso útil y práctico en comparación con enfoques numéricos más absolutos, como la estereología o la FC (12, 13, 23). Las ventajas obvias de DIA de las secciones 2D de pulmón completo incluyen, una vez que se han realizado las inversiones requeridas, su tiempo y costos relativamente bajos, alta viabilidad para análisis de alto rendimiento de grandes cantidades de muestras y su utilidad para estudios retrospectivos con material de archivo que por lo general no está incluido de forma aleatoria, como sería necesario para la estereología (12). Sin embargo, se deben considerar varios prerrequisitos técnicos críticos y limitaciones en el uso de datos. Primero, una preparación muy cuidadosa y altamente estandarizada de los pulmones parece crítica para excluir artefactos debidos a atelectasias por compresión o inflación desigual entre animales o grupos experimentales. Para lograr este nivel de homogeneidad, aquí utilizamos el método de ligadura traqueal completa inmediatamente después de la exhalación terminal para preservar completamente los volúmenes pulmonares originales. La homogeneidad de los tamaños de los pulmones se controló comparando las áreas transversales de los pulmones incrustados, que no arrojaron ninguna evidencia de grados variables de deflación o atelectasia. Un enfoque aún más estandarizado sería el inflado posmortal de los pulmones a la misma presión de inflado de 15 a 25 cm H2O según lo recomendado por la American Thoracic Society (24). En segundo lugar, la calidad de las secciones de tejido que se escanearán después del corte manual de bloques de parafina tiene un impacto tremendo en la aplicabilidad de DIA. Secciones de tejido más gruesas que aprox. Los cortes de 2 μm con fisuras o pliegues, los cortes comprimidos o los que se estiraron en exceso sobre portaobjetos de vidrio arrojaron resultados claramente erróneos en nuestras manos. Irónicamente, las habilidades manuales se convierten en un factor crítico para el éxito y la confiabilidad de los datos generados por el software. En tercer lugar, la intensidad y homogeneidad de la tinción de tejidos también pueden afectar la adquisición de datos de los portaobjetos escaneados, lo que hace imperativos los procedimientos de tinción altamente estandarizados. Es importante destacar que se recomienda el procesamiento por lotes y los análisis que abarquen a todos los animales y grupos de experimentación en el mismo flujo de trabajo estandarizado al máximo. Con este fin, deben incluirse los controles adecuados para las variaciones intraexperimentales y las diferencias en los procedimientos de corte o tinción. Además, la resolución de aproximadamente 0,25 μm / píxel lograda por los escáneres de histoslide promedio que utilizan un objetivo de 40 × es insuficiente para una diferenciación puramente morfológica de subtipos de células inmunes específicos (por ejemplo, neutrófilos frente a linfocitos) sin inmunomarcado específico de marcadores celulares. En ese sentido, el ojo del patólogo entrenado parece aún superior en el reconocimiento de patrones ópticos complejos de pequeño tamaño, posiblemente también debido a un plano z en microscopía real, que no se escaneó aquí. Además, la identificación confiable y el recuento de estructuras bacterianas individuales está claramente más allá de la resolución y la sensibilidad óptica de la tecnología actualmente disponible, lo que requiere enfoques en los que los patógenos se etiquetan inmunohistoquímicamente (16). Claramente, las deficiencias técnicas, como la sensibilidad óptica limitada y los efectos artificiales debido a variaciones manuales en el procesamiento de tejidos, representan desafíos futuros para futuras mejoras de esta metodología.

Por otro lado, los datos obtenidos por DIA a partir de secciones 2D de pulmón completo son insuficientes cuando se requieren cifras absolutas para todos los pulmones. El valor de un solo plano depende claramente de su representatividad para todo el órgano, que es limitada cuando las lesiones se distribuyen de manera no homogénea, como en la neumonía inducida por la mayoría de bacterias o virus (16). Encontramos un plano central único a través de los diámetros de los bronquios principales bastante útil cuando todos los pulmones a comparar estaban incrustados de una manera no aleatoria altamente estandarizada. Obviamente, la representatividad de todo el pulmón y más información sobre la distribución real de las lesiones se pueden mejorar aumentando el número de planos seriados analizados con distancias predefinidas en micrones o asignaciones anatómicas. Aún así, incluso si se analizan varios planos adicionales por pulmón para aumentar la precisión, los datos que se pueden obtener por DIA de los portaobjetos de todo el pulmón aún subyacen a las limitaciones generales que se aplican a la morfometría 2D, incluido el sesgo direccional y el sesgo de muestreo (5).

Aunque esta tecnología apenas está emergiendo, la DIA de secciones pulmonares completas de histopatología mejorará sustancialmente y ampliará las opciones de lectura y el valor científico de los estudios experimentales de neumonía en ratones y probablemente en otras especies.


¿Cómo puedo descargar un portaobjetos histológico de Cancer Digital Slide Archive - Biology?

Todos los artículos publicados por MDPI están disponibles inmediatamente en todo el mundo bajo una licencia de acceso abierto. No se requiere un permiso especial para reutilizar todo o parte del artículo publicado por MDPI, incluidas las figuras y tablas. Para los artículos publicados bajo una licencia Creative Common CC BY de acceso abierto, cualquier parte del artículo puede ser reutilizada sin permiso siempre que el artículo original esté claramente citado.

Los artículos de fondo representan la investigación más avanzada con un potencial significativo de alto impacto en el campo. Los artículos de fondo se envían por invitación individual o recomendación de los editores científicos y se someten a una revisión por pares antes de su publicación.

El artículo destacado puede ser un artículo de investigación original, un estudio de investigación novedoso y sustancial que a menudo implica varias técnicas o enfoques, o un artículo de revisión completo con actualizaciones concisas y precisas sobre los últimos avances en el campo que revisan sistemáticamente los avances científicos más interesantes. literatura. Este tipo de artículo proporciona una perspectiva sobre las futuras direcciones de la investigación o sus posibles aplicaciones.

Los artículos de Editor's Choice se basan en las recomendaciones de los editores científicos de las revistas de MDPI de todo el mundo. Los editores seleccionan una pequeña cantidad de artículos publicados recientemente en la revista que creen que serán particularmente interesantes para los autores o importantes en este campo. El objetivo es proporcionar una instantánea de algunos de los trabajos más interesantes publicados en las diversas áreas de investigación de la revista.


Acceso a imágenes de patología digital para sujetos TCGA en TCIA

Las imágenes de patología TCGA digitalizadas se pueden encontrar en Genomic Data Commons - GDC Legacy Archive. GDC es la fuente oficial de datos genómicos, clínicos y moleculares de TCGA.

Tenga en cuenta que donde dice la colección de The Cancer Imaging Archive:

Los identificadores de pacientes TCGA coincidentes permiten a los investigadores explorar las bases de datos de TCGA / TCIA en busca de correlaciones entre el genotipo de tejido, el fenotipo radiológico y los resultados del paciente.

esto significa que el identificador del paciente coincide en el sitio web de GDC (diapositivas, genotipo, información clínica) y TCIA (imágenes radiológicas, datos clínicos) NO coincidencia de casos / controles. Solo se incluyeron datos de pacientes.

Si ha descargado datos de radiología de algunos sujetos TCGA y desea acceder a las imágenes de patología, deberá seguir los siguientes pasos

  1. Recopile la identificación del paciente (por ejemplo, TCGA-A6-2672) y descargue los datos de radiología de TCIA
  2. Ir al archivo heredado de GDC
  3. Confirme que ve algo similar a la siguiente pantalla:

    Tipo de datos IS Imagen de portaobjetos de tejido o diagnóstico o ambos

MATERIALES Y MÉTODOS

Se obtuvo la aprobación de la junta de revisión institucional para este estudio (Universidad de Pittsburgh, Pensilvania, STUDY18100084, PRO17120392, Universidad de Witwatersrand, Johannesburgo, Sudáfrica, certificado de autorización M191003).

Creación de diapositivas flotantes de tejido

Para los propósitos de este experimento, se prepararon 3 portaobjetos de vidrio utilizando tejido tumoral humano adulto recién desechado (Figura 1). Se crearon artificialmente portaobjetos flotantes de tejido fabricados que contenían (1) una gran porción central de carcinoma de células renales obtenido de un carcinoma papilar de células renales tipo 1 (basófilo), y (2) colocados hacia el borde del portaobjetos 2 porciones adicionales más pequeñas separadas de tejido ("tejido flotante") obtenido de un adenocarcinoma de colon moderadamente diferenciado y un carcinoma urotelial papilar urotelial de alto grado de vejiga urinaria. Para evitar que estos portaobjetos se destaquen como extraordinarios en el estudio, los casos de patología seleccionados fueron relativamente fáciles de diagnosticar y típicos de lo que se encontraría en la práctica habitual. Además, los portaobjetos preparados se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & ampE) de acuerdo con los protocolos de tinción de rutina. A continuación, los 3 portaobjetos se digitalizaron por completo con un aumento de × 40 utilizando un escáner de portaobjetos completo Aperio AT2 (Leica Biosystems). Se verificó la calidad de estas diapositivas digitales para evitar la inclusión de identificadores únicos y / o artefactos.

Portaobjetos fabricado que contiene una sección de carcinoma de células renales (A) y 2 flotadores de tejido adyacentes separados de cáncer de colon (B) y cáncer de vejiga (C) (tinción de hematoxilina y eosina, insertos mostrados con un aumento de × 20).

Portaobjetos fabricado que contiene una sección de carcinoma de células renales (A) y 2 flotadores de tejido adyacentes separados de cáncer de colon (B) y cáncer de vejiga (C) (tinción de hematoxilina y eosina, insertos mostrados con un aumento de × 20).

Conjuntos de datos de diapositivas digitales de patología

Los WSI mencionados anteriormente se integraron en 2 conjuntos de datos de diapositivas digitales. El primer conjunto de datos se estableció seleccionando aleatoriamente 300 WSI anonimizados (formato de archivo .svs) de casos de patología quirúrgica teñidos con H & ampE de los archivos de enseñanza del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA ("conjunto de datos UPMC"). Estas diapositivas de archivo se escanearon con un aumento de × 40 utilizando un instrumento Aperio ScanScope XT (Leica Biosystems). Estos WSI incluyeron casos de una amplia variedad de sitios anatómicos (p. Ej., Colon, cerebro, tiroides, próstata, mama, riñón, glándula salival, piel, tejidos blandos, etc.) que presentaban diversas entidades patológicas de diagnóstico (es decir, neoplasias reactivas, inflamatorias, benignas y neoplasias). El otro conjunto de datos empleado en este estudio se obtuvo del archivo de diapositivas de patología digital disponible públicamente que ofrece el programa The Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://portal.gdc.cancer.gov). Se seleccionaron al azar un total de 2025 WSI y se descargaron del TCGA (“conjunto de datos TCGA”). Un WSI promedio fue de aproximadamente 45 000 × 45 000 píxeles. Las diapositivas digitales de baja calidad (p. Ej., Tinción muy deficiente, baja resolución, grandes regiones desenfocadas) se eliminaron con aumentos inferiores a × 20 y los parches borrosos evitan comprensiblemente que la búsqueda de imágenes funcione bien y la tinción deficiente afecta negativamente la extracción de características profundas.El conjunto de datos de TCGA incorporó al menos 33 entidades de diagnóstico diferentes de 25 ubicaciones anatómicas. Se incluyeron los portaobjetos TCGA de secciones congeladas y los portaobjetos con anotaciones manuales (marcas de bolígrafo) presentes. Todos los portaobjetos digitales se etiquetaron con el tipo de malignidad (diagnóstico primario) y el órgano afectado (sitio primario). Esta etiqueta se asignó a todo el WSI y no se delimitó ninguna región individual. La Tabla 1 muestra los 20 sitios principales con el mayor número de WSI en el conjunto de datos combinado (es decir, conjuntos de datos UPMC + TCGA).

Los 20 principales sitios con el mayor número de imágenes de diapositivas completas (WSI) en el conjunto de datos

BrdbvVh7dDXyun5J60iKvBkHdeCr1ukaubcBk4WI8BGoHZl6u4tyTHXNMnMr9UG5wDkKFVDcnfHCV-adcL2ebFBkcpuAvRe5UZcyQ8Gf9kFwUIITsPDZA7gmHx3ehEZZ1NAub-G2bVG7FNfGIlEriuQ __ y ampKey-Pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA"/>

Plataforma informática

Todos los experimentos se realizaron en un Dell EdgeServer Ra con 2x Intel (R) Xeon (R) Gold 5118 (12 núcleos, 2,30 GHz), 4x Telsa V100 (v-RAM 32 GB cada uno, solo se utilizaron 2 unidades de procesamiento de gráficos [GPU]) y memoria de acceso aleatorio de 394 GB. El código para la indexación se escribió en C / C ++. Los componentes de la interfaz de usuario se escribieron en varios idiomas, pero principalmente en Python y JavaScript. La potencia de la GPU de gama alta era necesaria para indexar los archivos grandes, que era una tarea única para los repositorios existentes. Para el uso diario de la búsqueda de imágenes, la unidad de procesamiento central / GPU ordinaria (de bajo costo) será suficiente, ya que los códigos de barras (ver más abajo) permiten una búsqueda eficiente en archivos grandes.

Herramienta de búsqueda de imágenes

A través de un enfoque de conjunto (utilizando una cohorte de diferentes algoritmos) se desarrolló un prototipo de motor de búsqueda confiable que aprovechó las fortalezas de los métodos computacionales supervisados ​​(redes profundas capacitadas) y no supervisados ​​(agrupamiento y búsqueda) para el procesamiento de imágenes. 23 Esta herramienta de búsqueda de imágenes incluía, por tanto, algoritmos de segmentación y agrupación, redes profundas y métricas de distancia para la búsqueda y recuperación. Mientras que las redes profundas son métodos supervisados ​​y requieren una amplia formación con datos etiquetados, la búsqueda en sí no está supervisada sin formación previa. El uso de una red profunda previamente entrenada sin un ajuste fino no constituye una supervisión directa porque se usa para la extracción de características sin ningún ajuste. Esto permite que nuestro enfoque sea independiente de los WSI delineados manualmente. Usamos DenseNet-121, que está disponible públicamente. Se utilizó la segmentación de imágenes para distinguir el tejido del fondo blanco. Los WSI se dividieron en parches o baldosas de tamaños fijos (por ejemplo, 500 × 500 μm 2 a × 20) sin superposición. Los parches se agruparon en categorías mediante métodos de agrupación (por ejemplo, algoritmo de k-medias) y se pasaron a través de redes neuronales artificiales previamente entrenadas para la minería de características. Cada vector de características se convirtió en un código de barras lineal (Figura 2) y este proceso de indexación de "grupo de códigos de barras" se utilizó para acelerar el proceso de recuperación de la búsqueda. 24 La generación de códigos de barras solo contenía binarización del cambio de gradiente de características profundas. Se examinaron múltiples medidas de similitud para aumentar aún más la tasa de coincidencia al comparar imágenes. Los parches de imágenes recuperados se clasificaron de mayor a menor probabilidad de ser similares a la imagen consultada (Figura 3) y estos resultados se muestran en un formato de galería para que el usuario final los revise e interprete. El rango (definido como la calificación de una coincidencia adecuada) se determinó por la similitud del parche sospechoso con todos los demás parches en el archivo, medido a través del cálculo de la distancia entre sus códigos de barras correspondientes. Cuanto más similar (es decir, el resultado mejor clasificado) sea el parche, menor será la diferencia entre los códigos de barras. Todos los parches coincidentes se ordenaron en función de esta diferencia (el menos diferente se clasifica en primer lugar y así sucesivamente).

Ilustración esquemática de la idea general de utilizar códigos de barras para la representación de imágenes: imagen de diapositiva completa indexada mediante la conversión de parches separados en códigos de barras.

Ilustración esquemática de la idea general de utilizar códigos de barras para la representación de imágenes: imagen de diapositiva completa indexada mediante la conversión de parches separados en códigos de barras.

Diagrama esquemático que muestra cómo se detecta el origen de un flotador sospechoso. El proceso comienza con la localización del fragmento de tejido sospechoso. Luego, un parche seleccionado del fragmento se alimenta a una red profunda previamente entrenada para extraer características. Luego, el motor de búsqueda recibe un código de barras generado para buscar dentro del "Índice Yottixel" que contiene códigos de barras de muchos parches de muchas imágenes de diapositivas completas (WSI). Finalmente, el origen del flotador se reconoce investigando los parches mejor clasificados.

Diagrama esquemático que muestra cómo se detecta el origen de un flotador sospechoso. El proceso comienza con la localización del fragmento de tejido sospechoso. Luego, un parche seleccionado del fragmento se introduce en una red profunda previamente entrenada para extraer características. Luego, el motor de búsqueda recibe un código de barras generado para buscar dentro del "Índice Yottixel" que contiene códigos de barras de muchos parches de muchas imágenes de diapositivas completas (WSI). Finalmente, el origen del flotador se reconoce investigando los parches mejor clasificados.

El usuario final (patólogo) puede seleccionar potencialmente cualquier fragmento de tejido para buscar en el archivo. Como tal, el patólogo inicia manualmente una búsqueda. El tamaño de parche más pequeño que se puede indexar y buscar es 500 × 500 μm (∼1000 × 1000 píxeles a × 20). Cualquier flotador más pequeño que ese puede no ser detectable.

Evaluación de la herramienta de búsqueda

Después de que las 3 diapositivas fabricadas antes mencionadas fueron escaneadas, indexadas y mezcladas entre millones de parches de imagen de los 2 conjuntos de datos, el número de parches se redujo a aproximadamente 16 000 parches mediante agrupamiento (establecido empíricamente en 9 grupos), mientras que solo el 5% de cada El clúster fue seleccionado para representar un WSI. A continuación, se utilizó la herramienta de búsqueda para intentar identificar el portaobjetos coincidente que pertenecía a cada flotador de tejido (Figura 4). La búsqueda se realizó utilizando porcentajes variables de muestreo de flotadores (es decir, 5% -100% de la región de flotadores de tejido seleccionada). La precisión de detección se midió ejecutando cada muestra 100 veces (manualmente y por automatización) y calculando el rango medio de una detección correcta entre los resultados de búsqueda, así como el mejor y el peor rango del flotador detectado entre los resultados de búsqueda usando un 95 % CI.

(A) Indexación de una muestra de imágenes de portaobjetos completos (escaneo con tumor de vejiga) (B) produciendo 33 parches para construir un mosaico. (C) Los códigos de barras correspondientes del mosaico se pueden generar utilizando un algoritmo MinMax. Se muestran los 3 códigos de barras que coinciden con los parches resaltados.

(A) Indexación de una muestra de imágenes de portaobjetos completos (escaneo con tumor de vejiga) (B) produciendo 33 parches para construir un mosaico. (C) Los códigos de barras correspondientes del mosaico se pueden generar utilizando un algoritmo MinMax. Se muestran los 3 códigos de barras que coinciden con los parches resaltados.


Patología por resonancia magnética de próstata

La recopilación y el análisis de datos fueron proporcionados por Anant Madabhushi, PhD, Case Western Reserve University y Michael D. Feldman, MD, PhD, Hospital de la Universidad de Pennsylvania. Este trabajo fue apoyado por NIH R01CA136535.

Referencias

  1. Singanamalli, A., Rusu, M., Sparks, RE, Shih, NN, Ziober, A., Wang, L., Tomaszewski, J., Rosen, M., Feldman, M. y Madabhushi, A. (2016) , Identificación de marcadores de resonancia magnética DCE in vivo asociados con la arquitectura de microvasos y los grados de gleason del cáncer de próstata. J. Magn. Reson. Imaging, 43: 149-158. doi: 10.1002 / jmri.24975 (PMID: 26110513).
  2. Toth, R, Feldman, M, Yu, D, Tomaszewski, J, Madabhushi, A. “Histostitcher ™: una plataforma de software de informática para la reconstrucción de histología prostática de montaje completo utilizando el marco de la plataforma de imágenes extensible (XIP ™),” Revista de informática de patología, vol. 5, pág. 8 de noviembre de 2014 (PMID: 24843820, PMCID: PMC4023035).
  3. Xiao, G, Bloch, N, Chappelow, J, Genega, E, Rofsky, N, Lenkinsky, R, Tomaszewski, J, Feldman, M, Rosen, M, Madabhushi, A. “Determinación de las correspondencias de cortes entre histología y resonancia magnética para definir las firmas de enfermedades del cáncer de próstata basadas en la resonancia magnética, ”Número especial de imágenes y gráficos médicos computarizados en el procesamiento de imágenes microscópicas de portaobjetos completos, vol. 35 [7-8], págs. 568-78, 2011 (PMID: 21255974).
  4. Chappelow, J, Bloch, N., Rofsky, N, Genega, E, Lenkinski, R, DeWolf, W, Madabhushi, A. “Registro elástico de histología y resonancia magnética de próstata multimodal a través de información mutua combinada de múltiples atributos, ”Física Médica, vol. 38 [4], págs. 2005-2018, 2011 (PMID: 21626933).

Acceso a los datos

Haga clic en el Descargar para guardar un archivo de manifiesto & quot.tcia & quot en su computadora, que debe abrir con NBIA Data Retriever. Haga clic en el Buscar para abrir nuestro Portal de datos, donde puede navegar por la recopilación de datos y / o descargar un subconjunto de su contenido.

Imágenes anotadas de patología de portaobjetos completo y anotaciones de amplificador (Tiff, XML 76,8 GB)


Ver el vídeo: Introduction: Neuroanatomy Video Lab - Brain Dissections (Agosto 2022).