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La multiplicación de fragmentos de ADN.


Con la fragmentación de las moléculas de ADN usando enzimas de restricción y su reconocimiento por electroforesis en gel, el siguiente paso es multiplicar (clonar) el fragmento obtenido y someterlos a la tecnología de ADN recombinante.

La técnica de multiplicación de cadenas de ADN se llama PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

En la década de 1980, la técnica de PCR se utilizó para hacer miles de copias de una sola pieza de ADN. Esta técnica se utiliza en tubos de ensayo que contienen ADN y algunos otros compuestos necesarios, como cebadores (ADN de cebador) y el Enzima ADN polimerasa (enzima que hace la replicación del ADN).

El cebadores son cadenas de ADN, con aproximadamente 20 bases (A, T, C, G) complementarias, es decir, se unen por complementariedad al comienzo de la secuencia de ADN que se multiplicará. Cuando se va a multiplicar una molécula de ADN, la doble cadena debe separarse, formando así dos cadenas diferentes pero complementarias. Cada cinta servirá como plantilla para la duplicación, por lo que necesitamos dos tipos diferentes de cebadores (ver figura)

Técnica de PCR, paso a paso

Se obtiene una muestra mínima de ADN de una célula humana.

  1. La muestra de ADN, la enzima de replicación (ADN polimerasa), los nucleótidos de ADN y los cebadores complementarios de la secuencia de ADN se colocan en un tubo de ensayo.
  2. El tubo de ensayo se coloca en una máquina de PCR (una máquina que sube y baja la temperatura según un programa). Los siguientes pasos de calentamiento y enfriamiento tienen lugar dentro de la máquina controlada por el programa.
  3. El tubo se calienta a 94 ° C para desnaturalizar (separar la doble cadena) el ADN.

4. Cada cadena individual de ADN desnaturalizado sirve como plantilla para la síntesis de nuevas cadenas complementarias. Para esto se enfría a 54ºC donde los cebadores suenan al comienzo de las dos tiras simples, sirviendo como cebadores para la enzima polimerasa.

5. El tubo se recalienta a 72 ° C (temperatura de funcionamiento ideal de la ADN polimerasa) para duplicar la tira. La ADN polimerasa comienza, después del final del cebador, a colocar los nucleótidos libres en la cadena de ADN uniéndolos, formando así una nueva doble cadena.