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Péptido aislado por afinidad

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¿Qué son los péptidos aislados por afinidad?
(No he estudiado biología desde los últimos 8 años y ahora lo estoy revisando porque lo necesito para mi investigación. Entonces, si alguien puede describirlo en un lenguaje simple, sería muy útil)


Se puede purificar un péptido o una proteína mediante cromatografía de afinidad. El principio es que el péptido tiene algún sustrato al que se unirá, retardando su avance a través de la columna en comparación con el resto de la población de péptidos. Un par de ejemplos típicos son:

  • Usando una etiqueta His6 colocada en moléculas recombinantes, IIRC se une al Ni2 + atrapado en la resina cromatográfica y se eluye con un quelante como EDTA.
  • Cromatografía de inmunoafinidad, donde tiene una población de anticuerpos en la resina cromatográfica que son específicos de la proteína que desea purificar (o, alternativamente, tienen el inmunógeno unido a la resina para que pueda purificar los anticuerpos contra ella)

Mighty Wikipedia tiene un enlace sobre cromatografía de afinidad aquí.


Cuantificación y análisis de proteínas

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad utiliza el principio de que la proteína se une a una molécula por la que tiene una afinidad específica. Esto se debe a que, en la mayoría de los casos, las proteínas llevan a cabo su actividad biológica mediante la unión o la formación de complejos con pequeñas moléculas o ligandos específicos. Esta pequeña molécula se puede inmovilizar mediante la unión covalente a la resina en una columna (fig. 8.6). Cuando la muestra pasa por la columna, la proteína de interés, al mostrar afinidad por su ligando, se une e inmoviliza. Por tanto, la proteína de interés se elimina de la mezcla de muestra. Finalmente, la proteína se disocia o eluye de la resina mediante la adición de altas concentraciones de ligando libre en solución. Debido a que este método se basa en la especificidad biológica de la proteína de interés, es un procedimiento muy eficaz. Un ejemplo típico son las resinas acopladas a un anticuerpo que reconoce una proteína específica, o puede contener un análogo no reactivo de un sustrato enzimático. El poder de la cromatografía de afinidad radica en la especificidad de unión entre el reactivo de afinidad en la resina y la molécula a purificar. Como tal, es posible diseñar un procedimiento de cromatografía de afinidad para purificar una proteína en un solo paso.

Figura 8.6. Cromatografía de afinidad para aislar moléculas según la capacidad de unión de ligandos.


Etiquetado TAP

La etiqueta TAP consta de dos dominios de unión a inmunoglobulina G (IgG) del Staphylococcus aureus proteína de superficie, proteína A y un péptido de unión a calmodulina (CBP). Estas dos partes están separadas por un péptido corto que es un objetivo para la proteasa TEV específica del sitio: una proteasa ampliamente disponible originalmente aislada del virus del grabado del tabaco (de ahí el nombre).

La proteína de interés etiquetada con TAP se aísla inicialmente del lisado celular a través de perlas recubiertas de IgG, que están estrechamente unidas por la proteína A que forma parte de la etiqueta. Después de lavar las perlas, la proteína etiquetada con TAP (y sus interactores) se puede liberar de las perlas incubando con proteasa TEV. Esto escinde la etiqueta TAP, dejando la parte de proteína A unida a las perlas, junto con cualquier proteína de unión a IgG no específica. Su proteína favorita, más la mitad de CBP de la etiqueta, se libera de las perlas. Como todavía está marcado con CBP, puede volver a purificarse con resina de Calmodulin, lavarse y eluirse.

Este proceso de purificación de dos pasos reduce en gran medida la cantidad de unión no específica que obtiene en su purificación de proteínas. Esto es realmente importante si, por ejemplo, desea identificar todos los socios de unión de su proteína favorita por especificación de masa. Al utilizar dos pasos de purificación separados, minimiza la probabilidad de que las proteínas falsas contaminen su purificación.

Desde la primera descripción de la etiqueta TAP, la purificación por afinidad en tándem se ha vuelto ampliamente utilizada en una gama cada vez mayor de sistemas modelo. Es de esperar que esta breve introducción le haya dado una idea de los principios básicos involucrados y las ventajas de utilizar un protocolo de dos etapas para purificar complejos de proteínas.

Para una revisión más completa de la purificación por afinidad en tándem, puede leer: Puig, Caspary, Rigaut et al. (2001) Métodos 24, 214-229. Alternativamente, si desea leer la descripción original, consulte: Rigaut, Shevchenko, Rutz y col. (1999) Nature Biotechnology 17 (10): 1030-2.


Un péptido novedoso aislado del ajo muestra un efecto anticancerígeno contra las líneas celulares leucémicas a través de la interacción con las proteínas de la familia Bcl-2.

Dalina Tanyong, Departamento de Microscopía Clínica, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Mahidol, Nakhon Pathom 73170, Tailandia.

Departamento de Microscopía Clínica, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Mahidol, Nakhon Pathom, Tailandia

Departamento de Ciencias de Laboratorio Médico, Facultad de Ciencias de la Salud Aliadas, Universidad de Jaffna, Jaffna, Sri Lanka

Centro de Minería de Datos e Informática Biomédica, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Mahidol, Nakhon Pathom, Tailandia

Grupo de Investigación de Ingredientes Funcionales e Innovación de Alimentos, Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología, Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología, Pathum Thani, Tailandia

Grupo de Investigación de Ingredientes Funcionales e Innovación de Alimentos, Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología, Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología, Pathum Thani, Tailandia

Departamento de Microscopía Clínica, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Mahidol, Nakhon Pathom, Tailandia

Dalina Tanyong, Departamento de Microscopía Clínica, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Mahidol, Nakhon Pathom 73170, Tailandia.

Abstracto

La leucemia es un grupo de cáncer causado por la proliferación y diferenciación anormales de las células madre hematopoyéticas. Se están realizando esfuerzos orientados a estrategias terapéuticas eficaces con efectos secundarios mínimos. Los péptidos derivados de recursos naturales han ganado recientemente una atención especial como agentes quimioterapéuticos alternativos debido a sus mínimos efectos adversos. En el presente estudio, el objetivo fue aislar péptidos de ajo (Allium sativum) e investigar su actividad anticancerígena frente a líneas celulares leucémicas. El extracto de proteína de A. sativum fue digerido con pepsina para obtener hidrolizado de proteína seguido de métodos de purificación secuencial. Un péptido anticáncer novedoso, VKLRSLLCS (VS-9), fue identificado y caracterizado por análisis espectrométrico de masas. Se demostró que el péptido inhibe significativamente la proliferación celular de las líneas celulares leucémicas MOLT-4 y K562 mientras exhibe una inhibición mínima contra PBMC normales. Particularmente, VS-9 podría inducir apoptosis y regular al alza los niveles de ARNm de caspasa 3, caspasa 8, caspasa 9, y Bax mientras regula a la baja Bcl-2, Bcl-xL, y Bcl-w. El acoplamiento molecular de VS-9 con la familia de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 sugirió que VS-9 podría unirse al surco de unión del dominio BH3 en las proteínas diana. El análisis de interacción proteína-péptido mediante cromatografía de afinidad y LC-MS / MS mostró además que VS-9 podría unirse a proteínas Bcl-2. Los resultados sugieren que VS-9 es un péptido anticáncer novedoso derivado del ajo potencial que posee propiedades inductoras de apoptosis contra líneas celulares leucémicas a través de la familia de proteínas antiapoptóticas Bcl-2.

Nombre del archivo Descripción
cbdd13831-sup-0001-FigS1.jpg Imagen JPEG, 118,9 KB Figura S1
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cbdd13831-sup-0006-FigS6.jpg Imagen JPEG, 425,6 KB Figura S6
cbdd13831-sup-0007-FigS7.jpg Imagen JPEG, 441,2 KB Figura S7
cbdd13831-sup-0008-TableS1.docxDocumento de Word, 17 KB Cuadro S1
cbdd13831-sup-0009-TableS2.docxDocumento de Word, 16,5 KB Cuadro S2
cbdd13831-sup-0010-TableS3.docxDocumento de Word, 16 KB Cuadro S3
cbdd13831-sup-0011-TableS4.docxDocumento de Word, 32 KB Cuadro S4
cbdd13831-sup-0012-SupFigLegends.docxDocumento de Word, 12,5 KB Material suplementario

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Aislamiento bioquímico de complejos proteicos Argonaute por Ago-APP

Durante el silenciamiento génico guiado por microARN (miARN), las proteínas Argonaute (Ago) interactúan con un miembro de la familia de proteínas TNRC6 / GW. Aquí utilizamos un péptido derivado de la proteína GW corto fusionado a GST y demostramos que se une a las proteínas Ago con alta afinidad. Esto permite el aislamiento simultáneo de todos los complejos de proteínas Ago expresados ​​en diversas especies para identificar proteínas asociadas, ARN pequeños o ARNm diana. Nos referimos a nuestro método como "Purificación por afinidad de proteínas Ago por péptidos" (Ago-APP). Además, la expresión de este péptido compite por las proteínas TNRC6 endógenas, lo que conduce a la inhibición global de la función de miARN en células de mamíferos.

Palabras clave: Argonaute GW Proteínas ARNi microARN ARN pequeños.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Cifras

Precipitación de complejos de Ago por ...

Precipitación de complejos Ago por Ago-APP. ( A ) Representación esquemática de…

Aislamiento y caracterización de Ago ...

Aislamiento y caracterización de complejos Ago de diferentes especies. ( A ) Hace-APP…

Ago-APP se puede utilizar para PAR – CLIP simultáneo de Ago1–4 humano. ( A )…

La expresión del péptido T6B inhibe endógenos ...

La expresión del péptido T6B inhibe el silenciamiento génico guiado por miARN endógeno. ( A ) Ensayos de luciferasa ...


Sistema secuencial de purificación por afinidad de péptidos para el aislamiento e identificación sistemáticos de complejos proteicos de Escherichia coli

La purificación bioquímica de proteínas marcadas por afinidad en combinación con métodos de espectrometría de masas se considera cada vez más una piedra angular de la biología de sistemas, ya que permite la caracterización sistemática a escala genómica de complejos de proteínas macromoleculares, que representan conjuntos demarcados de proteínas asociadas de interacción estable. La identificación precisa y sensible de los componentes polipeptídicos específicos y compartidos de distintos complejos requiere una purificación hasta casi la homogeneidad. Con este fin, se desarrolló un sistema de purificación secuencial por afinidad de péptidos (SPA) para permitir el aislamiento rápido y eficaz de los complejos de proteínas nativas de Escherichia coli (J Proteome Res 3: 463-468, 2004). La purificación de SPA utiliza una etiqueta de afinidad dual, que consta de tres secuencias FLAG modificadas (3X FLAG) y un péptido de unión a calmodulina (CBP), espaciados por un sitio de escisión para la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (J Proteome Res 3: 463 -468, 2004). Utilizando el sistema de recombinación homóloga roja del fago lambda (PNAS 97: 5978-5983, 2000), se introduce un casete de ADN, que codifica la etiqueta SPA y un marcador seleccionable flanqueado por secuencias de direccionamiento específicas de genes, en un locus seleccionado en el E .coli cromosoma para crear una fusión C-terminal con la proteína de interés. Este procedimiento tiene como objetivo niveles casi endógenos de producción de proteínas marcadas en las bacterias recombinantes para evitar asociaciones de proteínas no específicas y espurias (J Proteome Res 3: 463-468, 2004). En este capítulo, describimos un protocolo optimizado y detallado para el etiquetado, la purificación y la posterior identificación basada en espectrometría de masas de las subunidades de complejos de proteínas bacterianas incluso de baja abundancia aislados como parte de un estudio proteómico a gran escala en curso en E. coli. (Nature 433: 531-537, 2005).


Aislamiento, clonación y sobreexpresión de un fragmento del gen de quitinasa de la arqueona hipertermofílica Thermococcus chitonophagus: purificación semidesnaturalizante del péptido recombinante e investigación de su relación con otras quitinasas

Se aisló una secuencia de 189 pb del archaeon hipertermófilo Thermococcus chitonophagus y se encontró que presentaba una fuerte homología con un gran número de genes de quitinasa de una variedad de organismos y particularmente con el gen de quitinasa A de Pyrococcus kodakaraensis (Pk-chiA). Este fragmento se subclonó en un vector de expresión y se sobreexpresó en Escherichia coli. Se descubrió que el transformante E. coli BLR21 (DE3) pLysS, que alberga el gen en el vector plasmídico pET-31b, sobreproduce la proteína diana a niveles elevados. El péptido de 63 aminoácidos de longitud se purificó eficazmente hasta homogeneidad, con una cromatografía de afinidad semidesnaturalizante de un solo paso, en una resina de quelación de metales y se utilizó para la producción de un anticuerpo policlonal específico de conejos. Se demostró que el anticuerpo producido mostraba una afinidad fuerte y específica por la quitinasa A de Serratia marcescens (Sm-chiA), así como la quitinasa 70 unida a membrana de Thermococcus chitonophagus (Tc-Chi70). La fuerte homología de secuencia, en combinación con la afinidad inmunoquímica específica demostrada, indica que el péptido aislado es parte de una enzima quitinolítica de T. chitonophagus. En particular, podría pertenecer al chi70 unido a la membrana, oa una quitinasa distinta, codificada por un gen diferente, o incluso por el mismo gen, siguiendo modificaciones postranscripcionales o postraduccionales.


Inmunoprecipitación de proteínas individuales (IP) Editar

Implica el uso de un anticuerpo que es específico para una proteína conocida para aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones estarán a menudo en forma de lisado crudo de un tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras pueden ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.

Inmunoprecipitación de complejos de proteínas (Co-IP) Editar

La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, el antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como co-inmunoprecipitación (Co-IP). Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo más grande de proteínas. Al apuntar a esto conocido miembro con un anticuerpo, puede ser posible extraer todo el complejo proteico de la solución y así identificar desconocido miembros del complejo.

Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen entre sí estrechamente, lo que hace posible sacar varios miembros del complejo de la solución al adherirse a un miembro con un anticuerpo. Este concepto de extraer complejos de proteínas de la solución a veces se denomina "extracción". Co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína.

  • Un anticuerpo particular a menudo selecciona una subpoblación de su proteína diana que tiene el epítopo expuesto, por lo que no logra identificar ninguna proteína en los complejos que ocultan el epítopo. Esto se puede ver en que rara vez es posible precipitar incluso la mitad de una proteína dada de una muestra con un solo anticuerpo, incluso cuando se usa un gran exceso de anticuerpo.
  • A medida que tienen lugar rondas sucesivas de direccionamiento e inmunoprecipitaciones, el número de proteínas identificadas puede seguir creciendo. Es posible que las proteínas identificadas no existan nunca en un solo complejo en un momento dado, sino que pueden representar una red de proteínas que interactúan entre sí en diferentes momentos para diferentes propósitos.
  • Repetir el experimento apuntando a diferentes miembros del complejo de proteínas permite al investigador verificar el resultado. Cada ronda de pull-downs debería resultar en la recuperación tanto de la proteína conocida original como de otros miembros del complejo previamente identificados (e incluso nuevos miembros adicionales). Al repetir la inmunoprecipitación de esta manera, el investigador verifica que cada miembro identificado del complejo proteico sea una identificación válida. Si una proteína en particular solo puede recuperarse dirigiéndose a uno de los miembros conocidos pero no dirigiéndose a otro de los miembros conocidos, entonces el estado de esa proteína como miembro del complejo puede estar sujeto a dudas.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Editar

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma de una proteína de interés particular. Esta técnica da una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células o tejidos vivos. los en vivo La naturaleza de este método contrasta con otros enfoques empleados tradicionalmente para responder a las mismas preguntas.

El principio que sustenta este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas) en las células vivas pueden reticularse con el ADN al que se unen. Mediante el uso de un anticuerpo que es específico de una supuesta proteína de unión al ADN, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de los lisados ​​celulares. La reticulación a menudo se logra aplicando formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso utilizar un reticulante más definido y consistente como di-tert-peróxido de butilo (DTBP). Después de la reticulación, las células se lisan y el ADN se rompe en pedazos de 0,2 a 1,0 kb de longitud mediante sonicación. En este punto, se realiza la inmunoprecipitación que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Los complejos purificados de proteína-ADN luego se calientan para revertir el entrecruzamiento de formaldehído de los complejos de proteína y ADN, lo que permite que el ADN se separe de las proteínas. La identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislados se pueden determinar luego mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica está siendo el objetivo para generar los cebadores de PCR correctos. A veces, esta limitación se evita simplemente clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico y luego usando cebadores que son específicos de la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando se quiere encontrar dónde se une la proteína en una escala de todo el genoma, se utiliza la secuenciación de ChIP y ha surgido recientemente como una tecnología estándar que puede localizar los sitios de unión de proteínas de una manera rentable y de alto rendimiento, permitiendo también para la caracterización del cistroma. Anteriormente, también se utilizaba el microarray de ADN (ChIP-on-chip o ChIP-chip).

Inmunoprecipitación RNP (RIP) Editar

Similar a la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) descrita anteriormente, pero en lugar de dirigirse a las proteínas de unión al ADN como en el ChIP, una inmunoprecipitación de RNP se dirige a las ribonucleoproteínas (RNP). [1] Las células vivas se lisan primero y luego la proteína diana y el ARN asociado se inmunoprecipitan utilizando un anticuerpo que se dirige a la proteína de interés. Los complejos purificados de ARN-proteína se pueden separar realizando una extracción de ARN y la identidad del ARN se puede determinar mediante secuenciación de ADNc [2] o RT-PCR. Algunas variantes de RIP, como PAR-CLIP, incluyen pasos de reticulación, que luego requieren condiciones de lisis menos cuidadosas.

Proteínas etiquetadas Editar

Uno de los principales obstáculos técnicos de la inmunoprecipitación es la gran dificultad para generar un anticuerpo que se dirija específicamente a una única proteína conocida. Para sortear este obstáculo, muchos grupos diseñarán etiquetas en el extremo C- o N- terminal de la proteína de interés. La ventaja aquí es que la misma etiqueta se puede usar una y otra vez en muchas proteínas diferentes y el investigador puede usar el mismo anticuerpo cada vez. Las ventajas de usar proteínas etiquetadas son tan grandes que esta técnica se ha convertido en un lugar común para todos los tipos de inmunoprecipitación, incluidos todos los tipos de IP detallados anteriormente. Ejemplos de etiquetas en uso son la etiqueta de proteína verde fluorescente (GFP), la etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST) y la etiqueta de etiqueta FLAG. Si bien el uso de una etiqueta para habilitar los desplegables es conveniente, plantea algunas preocupaciones con respecto a la relevancia biológica porque la etiqueta en sí puede ocultar las interacciones nativas o introducir interacciones nuevas y no naturales.

Los dos métodos generales de inmunoprecipitación son el método de captura directa y el método de captura indirecta.

Edición directa

Los anticuerpos que son específicos para una proteína particular (o grupo de proteínas) se inmovilizan en un sustrato en fase sólida, como microperlas superparamagnéticas o en microesferas de agarosa (no magnéticas) microscópicas. Las perlas con anticuerpos unidos se agregan luego a la mezcla de proteínas y las proteínas que son el objetivo de los anticuerpos se capturan en las perlas a través de los anticuerpos, en otras palabras, se inmunoprecipitan.

Edición indirecta

Los anticuerpos que son específicos para una proteína en particular, o un grupo de proteínas, se agregan directamente a la mezcla de proteínas. Los anticuerpos aún no se han unido a un soporte en fase sólida. Los anticuerpos pueden flotar libremente alrededor de la mezcla de proteínas y unirse a sus objetivos. A medida que pasa el tiempo, se añaden perlas recubiertas de proteína A / G a la mezcla de anticuerpo y proteína. En este punto, los anticuerpos, que ahora están unidos a sus objetivos, se adherirán a las perlas.

A partir de este momento, los protocolos directos e indirectos convergen porque las muestras ahora tienen los mismos ingredientes. Ambos métodos dan el mismo resultado final con la proteína o los complejos proteicos unidos a los anticuerpos que ellos mismos están inmovilizados sobre las perlas.

Selección Editar

A veces se prefiere un enfoque indirecto cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica del anticuerpo por la proteína es débil. El método indirecto también se utiliza cuando la cinética de unión del anticuerpo a la proteína es lenta por diversas razones. En la mayoría de las situaciones, el método directo es la opción predeterminada y preferida.

Agarosa Editar

Históricamente, el soporte en fase sólida para la inmunoprecipitación utilizado por la mayoría de los científicos ha sido muy poroso. perlas de agarosa (también conocido como resinas de agarosa o lodos). La ventaja de esta tecnología es una capacidad de unión potencial muy alta, ya que prácticamente toda la estructura esponjosa de la partícula de agarosa (de 50 a 150 μm de tamaño) está disponible para la unión de anticuerpos (que a su vez se unirán a las proteínas diana) y el uso de equipos de laboratorio estándar para todos los aspectos del protocolo IP sin la necesidad de ningún equipo especializado. La ventaja de una capacidad de unión extremadamente alta debe equilibrarse cuidadosamente con la cantidad de anticuerpo que el investigador está preparado para usar para recubrir las perlas de agarosa. Debido a que los anticuerpos pueden ser un factor limitante de costos, es mejor calcular hacia atrás de la cantidad de proteína que necesita ser capturada (dependiendo del análisis que se realice en sentido descendente), para la cantidad de anticuerpo que se requiere para unir esa cantidad de proteína (con un pequeño exceso agregado para tener en cuenta las ineficiencias del sistema), y aún más atrás para la cantidad de agarosa que se necesita para unir esa cantidad particular de anticuerpo. En los casos en que no se requiere la saturación de anticuerpos, esta tecnología no tiene rival en su capacidad para capturar cantidades extremadamente grandes de proteínas objetivo capturadas. La advertencia aquí es que "ventaja de alta capacidad" puede convertirse en un "desventaja de alta capacidad" que se manifiesta cuando la enorme capacidad de unión de las perlas de sefarosa / agarosa no está completamente saturada de anticuerpos. A menudo sucede que la cantidad de anticuerpo disponible para el investigador para su experimento de inmunoprecipitación es menos que suficiente para saturar las perlas de agarosa que se utilizarán en la inmunoprecipitación. En estos casos, el investigador puede terminar con partículas de agarosa que solo están parcialmente recubiertas con anticuerpos, y la parte de la capacidad de unión de las perlas de agarosa que no está recubierta con anticuerpo queda libre para unirse a cualquier cosa que se adhiera, lo que resulta en un aumento señal de fondo debido a la unión no específica de los componentes del lisado a las perlas, lo que puede dificultar la interpretación de los datos. Si bien algunos pueden argumentar que por estas razones es prudente hacer coincidir la cantidad de agarosa (en términos de capacidad de unión) con la cantidad de anticuerpo que se desea unir para la inmunoprecipitación, una forma sencilla de reducir el problema de la inmunoprecipitación no específica. la unión a las perlas de agarosa y el aumento de la especificidad es para aclarar previamente el lisado, que para cualquier inmunoprecipitación es muy recomendable. [3] [4]

Preliminar Editar

Los lisados ​​son mezclas complejas de proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, y se debe suponer que se producirá una cierta cantidad de unión no específica al anticuerpo IP, la proteína A / G o el soporte de perlas y afectará negativamente la detección de la diana inmunoprecipitada. (s). En la mayoría de los casos, preclaro el lisado al comienzo de cada experimento de inmunoprecipitación (consulte el paso 2 en la sección "protocolo" a continuación) [5] es una forma de eliminar los componentes potencialmente reactivos del lisado celular antes de la inmunoprecipitación para evitar la unión no específica de estos componentes a las perlas IP o al anticuerpo. El procedimiento básico de aclarado previo se describe a continuación, en el que el lisado se incuba con perlas solas, que luego se eliminan y descartan antes de la inmunoprecipitación. [5] Sin embargo, este enfoque no tiene en cuenta la unión no específica al anticuerpo IP, que puede ser considerable. Por lo tanto, un método alternativo de aclarado previo es incubar la mezcla de proteínas con exactamente los mismos componentes que se usarán en la inmunoprecipitación, excepto que se usa un anticuerpo irrelevante no objetivo de la misma subclase de anticuerpos que el anticuerpo IP en lugar del IP. el propio anticuerpo. [4] Este enfoque intenta utilizar lo más cercano a las condiciones y componentes IP exactos como la inmunoprecipitación real para eliminar cualquier constituyente celular no específico sin capturar la proteína diana (a menos, por supuesto, que la proteína diana se una de manera no específica a alguna otra Componente IP, que debe controlarse adecuadamente mediante el análisis de las perlas desechadas utilizadas para limpiar previamente el lisado). A continuación, la proteína diana puede inmunoprecipitarse con el riesgo reducido de que la unión no específica interfiera con la interpretación de los datos.

Cuentas superparamagnéticas Editar

Si bien la gran mayoría de las inmunoprecipitaciones se realizan con perlas de agarosa, el uso de perlas superparamagnéticas para la inmunoprecipitación es un enfoque más nuevo que está ganando popularidad como alternativa a las perlas de agarosa para aplicaciones IP. A diferencia de la agarosa, las perlas magnéticas son sólidas y pueden ser esféricas, según el tipo de perla, y la unión del anticuerpo se limita a la superficie de cada perla. Si bien estas perlas no tienen la ventaja de un centro poroso para aumentar la capacidad de unión, las perlas magnéticas son significativamente más pequeñas que las perlas de agarosa (1 a 4 μm), y el mayor número de perlas magnéticas por volumen que las perlas de agarosa da colectivamente a las perlas magnéticas un efecto eficaz. relación superficie-volumen para una unión óptima de anticuerpos.

Las perlas magnéticas disponibles comercialmente se pueden separar basándose en la uniformidad de tamaño en perlas monodispersas y polidispersas. Las perlas monodispersas, también llamadas microperlas, exhiben una uniformidad exacta y, por lo tanto, todas las perlas exhiben características físicas idénticas, incluida la capacidad de unión y el nivel de atracción a los imanes. Las perlas polidispersas, si bien son de tamaño similar a las perlas monodispersas, muestran una amplia gama de variabilidad de tamaño (1 a 4 μm) que puede influir en su capacidad de unión y captura magnética. Aunque ambos tipos de perlas están disponibles comercialmente para aplicaciones de inmunoprecipitación, las perlas superparamagnéticas monodispersas de mayor calidad son más ideales para protocolos automáticos debido a su tamaño, forma y rendimiento consistentes. Muchas empresas, incluidas Invitrogen, Thermo Scientific y Millipore, ofrecen perlas superparamagnéticas monodispersas y polidispersas.

Agarosa vs perlas magnéticas Editar

Los defensores de las perlas magnéticas afirman que las perlas exhiben una tasa más rápida de unión a proteínas [6] [7] [8] que las perlas de agarosa para aplicaciones de inmunoprecipitación, aunque las inmunoprecipitaciones estándar basadas en perlas de agarosa se han realizado en 1 hora. [4] También se ha afirmado que las perlas magnéticas son mejores para inmunoprecipitar complejos de proteínas extremadamente grandes debido a la falta total de un límite de tamaño superior para dichos complejos, [6] [7] [9] aunque no hay evidencia imparcial que lo indique. afirmar. La naturaleza de la tecnología de perlas magnéticas da como resultado una menor manipulación de muestras [7] debido a la reducción del estrés físico en las muestras de separación magnética frente a la centrifugación repetida cuando se usa agarosa, lo que puede contribuir en gran medida a aumentar el rendimiento de complejos proteicos lábiles (frágiles). [7] [8] [9] Sin embargo, en la selección de un soporte de inmunoprecipitación se deben considerar factores adicionales, como la capacidad de unión, el costo del reactivo, el requisito de equipo adicional y la capacidad para automatizar los procesos de IP.

Capacidad de encuadernación Editar

Los defensores de las perlas de agarosa y magnéticas pueden argumentar si la gran diferencia en las capacidades de unión de las dos perlas favorece un tipo particular de perlas. En una comparación entre perlas, las perlas de agarosa tienen un área de superficie significativamente mayor y, por lo tanto, una mayor capacidad de unión que las perlas magnéticas debido al gran tamaño de las perlas y la estructura similar a una esponja. Pero el tamaño de poro variable de la agarosa causa un límite de tamaño superior potencial que puede afectar la unión de proteínas o complejos de proteínas extremadamente grandes a sitios de unión internos y, por lo tanto, las perlas magnéticas pueden ser más adecuadas para inmunoprecipitar proteínas o complejos de proteínas grandes que las perlas de agarosa. aunque hay una falta de evidencia comparativa independiente que pruebe ambos casos.

Algunos argumentan que la capacidad de unión significativamente mayor de las perlas de agarosa puede ser una desventaja debido a la mayor capacidad de unión no específica. Otros pueden abogar por el uso de perlas magnéticas debido a la mayor cantidad de anticuerpo requerida para saturar la capacidad de unión total de las perlas de agarosa, lo que obviamente sería una desventaja económica del uso de agarosa. Si bien estos argumentos son correctos fuera del contexto de su uso práctico, estas líneas de razonamiento ignoran dos aspectos clave del principio de inmunoprecipitación que demuestra que la decisión de usar agarosa o perlas magnéticas no está simplemente determinada por la capacidad de unión.

En primer lugar, la unión no específica no se limita a los sitios de unión del anticuerpo en el soporte inmovilizado; cualquier superficie del anticuerpo o componente de la reacción de inmunoprecipitación puede unirse a constituyentes de lisado no específicos y, por lo tanto, la unión inespecífica seguirá ocurriendo incluso cuando las perlas estén completamente saturadas. usó. Por eso es importante aclarar previamente la muestra antes de realizar la inmunoprecipitación.

En segundo lugar, la capacidad para capturar la proteína diana depende directamente de la cantidad de anticuerpo inmovilizado utilizado y, por lo tanto, en una comparación lado a lado de la inmunoprecipitación de agarosa y perlas magnéticas, la mayor cantidad de proteína que cualquiera de los soportes puede capturar está limitada por el cantidad de anticuerpo añadido. Entonces, la decisión de saturar cualquier tipo de soporte depende de la cantidad de proteína requerida, como se describe anteriormente en la sección Agarosa de esta página.

Costo Editar

El precio de usar cualquier tipo de soporte es un factor determinante clave en el uso de agarosa o perlas magnéticas para aplicaciones de inmunoprecipitación. Un cálculo típico a primera vista sobre el costo de las perlas magnéticas en comparación con las perlas de sefarosa puede hacer que las perlas de sefarosa parezcan menos costosas. Pero las perlas magnéticas pueden tener un precio competitivo en comparación con la agarosa para inmunoprecipitaciones a escala analítica, según el método IP utilizado y el volumen de perlas requerido por reacción IP.

Using the traditional batch method of immunoprecipitation as listed below, where all components are added to a tube during the IP reaction, the physical handling characteristics of agarose beads necessitate a minimum quantity of beads for each IP experiment (typically in the range of 25 to 50μl beads per IP). This is because sepharose beads must be concentrated at the bottom of the tube by centrifugation and the supernatant removed after each incubation, wash, etc. This imposes absolute physical limitations on the process, as pellets of agarose beads less than 25 to 50μl are difficult if not impossible to visually identify at the bottom of the tube. With magnetic beads, there is no minimum quantity of beads required due to magnetic handling, and therefore, depending on the target antigen and IP antibody, it is possible to use considerably less magnetic beads.

Conversely, spin columns may be employed instead of normal microfuge tubes to significantly reduce the amount of agarose beads required per reaction. Spin columns contain a filter that allows all IP components except the beads to flow through using a brief centrifugation and therefore provide a method to use significantly less agarose beads with minimal loss.

Equipment Edit

As mentioned above, only standard laboratory equipment is required for the use of agarose beads in immunoprecipitation applications, while high-power magnets are required for magnetic bead-based IP reactions. While the magnetic capture equipment may be cost-prohibitive, the rapid completion of immunoprecipitations using magnetic beads may be a financially beneficial approach when grants are due, because a 30-minute protocol with magnetic beads compared to overnight incubation at 4 °C with agarose beads may result in more data generated in a shorter length of time. [6] [7] [8]

Automation Edit

An added benefit of using magnetic beads is that automated immunoprecipitation devices are becoming more readily available. These devices not only reduce the amount of work and time to perform an IP, but they can also be used for high-throughput applications.

Summary Edit

While clear benefits of using magnetic beads include the increased reaction speed, more gentle sample handling and the potential for automation, the choice of using agarose or magnetic beads based on the binding capacity of the support medium and the cost of the product may depend on the protein of interest and the IP method used. As with all assays, empirical testing is required to determine which method is optimal for a given application.

Background Edit

Once the solid substrate bead technology has been chosen, antibodies are coupled to the beads and the antibody-coated-beads can be added to the heterogeneous protein sample (e.g. homogenized tissue). At this point, antibodies that are immobilized to the beads will bind to the proteins that they specifically recognize. Once this has occurred the immunoprecipitation portion of the protocol is actually complete, as the specific proteins of interest are bound to the antibodies that are themselves immobilized to the beads. Separation of the immunocomplexes from the lysate is an extremely important series of steps, because the protein(s) must remain bound to each other (in the case of co-IP) and bound to the antibody during the wash steps to remove non-bound proteins and reduce background.

When working with agarose beads, the beads must be pelleted out of the sample by briefly spinning in a centrifuge with forces between 600–3,000 x g (times the standard gravitational force). This step may be performed in a standard microcentrifuge tube, but for faster separation, greater consistency and higher recoveries, the process is often performed in small spin columns with a pore size that allows liquid, but not agarose beads, to pass through. After centrifugation, the agarose beads will form a very loose fluffy pellet at the bottom of the tube. The supernatant containing contaminants can be carefully removed so as not to disturb the beads. The wash buffer can then be added to the beads and after mixing, the beads are again separated by centrifugation.

With superparamagnetic beads, the sample is placed in a magnetic field so that the beads can collect on the side of the tube. This procedure is generally complete in approximately 30 seconds, and the remaining (unwanted) liquid is pipetted away. Washes are accomplished by resuspending the beads (off the magnet) with the washing solution and then concentrating the beads back on the tube wall (by placing the tube back on the magnet). The washing is generally repeated several times to ensure adequate removal of contaminants. If the superparamagnetic beads are homogeneous in size and the magnet has been designed properly, the beads will concentrate uniformly on the side of the tube and the washing solution can be easily and completely removed.

After washing, the precipitated protein(s) are eluted and analyzed by gel electrophoresis, mass spectrometry, western blotting, or any number of other methods for identifying constituents in the complex. Protocol times for immunoprecipitation vary greatly due to a variety of factors, with protocol times increasing with the number of washes necessary or with the slower reaction kinetics of porous agarose beads.


Engineering antibody therapeutics

Therapeutic Abs come from critical screenings of en vivo y in vitro métodos.

Bispecific Abs increase specificity and broaden the range of therapeutic MOA.

Optimized Ab leads undergo HFA, affinity maturation, and developability assessment.

Fc optimization is critical for antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics.

The successful introduction of antibody-based protein therapeutics into the arsenal of treatments for patients has within a few decades fostered intense innovation in the production and engineering of antibodies. Reviewed here are the methods currently used to produce antibodies along with how our knowledge of the structural and functional characterization of immunoglobulins has resulted in the engineering of antibodies to produce protein therapeutics with unique properties, both biological and biophysical, that are leading to novel therapeutic approaches. Antibody engineering includes the introduction of the antibody combining site (variable regions) into a host of architectures including bi and multi-specific formats that further impact the therapeutic properties leading to further advantages and successes in patient treatment.


Chemical and Synthetic Biology Approaches To Understand Cellular Functions - Part C

Hemlata Dwivedi-Agnihotri , . Arun K. Shukla , in Methods in Enzymology , 2020

2.2 Reagents for capture and detection of biotinylated proteins

Pre-cast or manually prepared acrylamide gels for SDS-PAGE

Suitable power supply and SDS-PAGE apparatus

Protein molecular weight marker

Chemicals for different buffers (Tris–HCl, Glycine, Methanol, Tween-20, Hydrochloric acid)


Ver el vídeo: Ejercicio cálculo de pI de un péptido (Agosto 2022).