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¿Cuánto tiempo puedo almacenar el ARN extraído?

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Si extraigo ARN de una muestra (de tejido foliar) utilizando una extracción de fenol: cloroformo en un solo paso, ¿cuánto tiempo se pueden almacenar esas muestras a -80 ° C? ¿Y cuántas veces puedo descongelarlos y volver a congelarlos antes de que se degraden?


Descubrí que el ARN extraído usando kits comerciales se ha mantenido estable durante muchos años a -80 C. Sin embargo, lo tomaría en alícuotas antes de congelarlo, ya que el ARN es particularmente sensible a la división por congelación-descongelación.


Podemos mantener el ARN extraído a -80 ° C durante algunas semanas, pero antes del inicio de cualquier experimento, es necesario validarlo mediante electroforesis en gel.


Mantengo mi ARN en citrato de sodio 1 mM, pH 6,4. El citrato es un quelante y ayuda a atrapar los metales divalentes que muchas ARNas necesitan para funcionar. El pH más bajo también ayuda a inhibir la actividad de la ARNasa. El EDTA podría funcionar como un quelante, pero solo quela bien a pH donde la actividad de la ARNasa es peor. El citrato proporciona tanto quelación como pH bajo.

Por supuesto, también mantengo mi ARN en -80.


Los biólogos 'transfieren' un recuerdo a través de la inyección de ARN

Los biólogos de UCLA informan que han transferido una memoria de un caracol marino a otro, creando una memoria artificial, inyectando ARN de uno a otro. Esta investigación podría conducir a nuevas formas de disminuir el trauma de los recuerdos dolorosos con ARN y restaurar los recuerdos perdidos.

"Creo que en un futuro no muy lejano, podríamos usar ARN para mejorar los efectos de la enfermedad de Alzheimer o el trastorno de estrés postraumático", dijo David Glanzman, autor principal del estudio y profesor de biología y fisiología integrativas de UCLA. y de neurobiología. La investigación del equipo se publica el 14 de mayo en eNeuro, la revista en línea de la Society for Neuroscience.

El ARN, o ácido ribonucleico, ha sido ampliamente conocido como un mensajero celular que produce proteínas y lleva a cabo las instrucciones del ADN a otras partes de la célula. Ahora se entiende que tiene otras funciones importantes además de la codificación de proteínas, incluida la regulación de una variedad de procesos celulares involucrados en el desarrollo y la enfermedad.

Los investigadores aplicaron descargas eléctricas leves a las colas de una especie de caracol marino llamado Aplysia. Los caracoles recibieron cinco choques en la cola, uno cada 20 minutos y luego cinco más 24 horas después. Los choques mejoran el reflejo de retirada defensiva del caracol, una respuesta que muestra para protegerse de posibles daños. Cuando los investigadores posteriormente tocaron los caracoles, encontraron que los que habían recibido las descargas mostraban una contracción defensiva que duró un promedio de 50 segundos, un tipo simple de aprendizaje conocido como "sensibilización". Aquellos que no habían recibido las descargas se contrajeron durante solo un segundo.

Los científicos de la vida extrajeron ARN del sistema nervioso de los caracoles marinos que recibieron los choques de la cola el día después de la segunda serie de choques, y también de los caracoles marinos que no recibieron ningún choque. Luego, el ARN del primer grupo (sensibilizado) se inyectó en siete caracoles marinos que no habían recibido ninguna descarga, y el ARN del segundo grupo se inyectó en un grupo de control de otros siete caracoles que tampoco habían recibido ninguna descarga.

Sorprendentemente, los científicos encontraron que los siete que recibieron el ARN de los caracoles que recibieron las descargas se comportaron como si ellos mismos hubieran recibido las descargas de la cola: mostraron una contracción defensiva que duró un promedio de unos 40 segundos.

"Es como si hubiéramos transferido la memoria", dijo Glanzman, quien también es miembro del Instituto de Investigación del Cerebro de UCLA.

Como era de esperar, el grupo de control de caracoles no mostró la contracción prolongada.

A continuación, los investigadores agregaron ARN a placas de Petri que contenían neuronas extraídas de diferentes caracoles que no recibieron descargas. Algunos platos tenían ARN de caracoles marinos que habían recibido descargas eléctricas en la cola, y algunos platos contenían ARN de caracoles que no habían recibido descargas. Algunos de los platos contenían neuronas sensoriales y otros contenían neuronas motoras, que en el caracol son responsables del reflejo.

Cuando un caracol marino recibe descargas eléctricas en la cola, sus neuronas sensoriales se vuelven más excitables. Curiosamente, los investigadores descubrieron que la adición de ARN de los caracoles que habían recibido descargas también producía una mayor excitabilidad en las neuronas sensoriales en una placa de Petri, pero no en las neuronas motoras. La adición de ARN de un caracol marino que no recibió los choques de la cola no produjo este aumento de la excitabilidad en las neuronas sensoriales.

En el campo de la neurociencia, se ha pensado durante mucho tiempo que los recuerdos se almacenan en sinapsis. (Cada neurona tiene varios miles de sinapsis). Glanzman tiene un punto de vista diferente y cree que los recuerdos se almacenan en el núcleo de las neuronas.

"Si los recuerdos se hubieran almacenado en las sinapsis, no habría forma de que nuestro experimento hubiera funcionado", dijo Glanzman, quien agregó que el caracol marino es un modelo excelente para estudiar el cerebro y la memoria.

Los científicos saben más sobre la biología celular de esta forma simple de aprendizaje en este animal que cualquier otra forma de aprendizaje en cualquier otro organismo, dijo Glanzman. Los procesos celulares y moleculares parecen ser muy similares entre el caracol marino y los humanos, a pesar de que el caracol tiene alrededor de 20,000 neuronas en su sistema nervioso central y se cree que los humanos tienen alrededor de 100 mil millones.

En el futuro, dijo Glanzman, es posible que el ARN se pueda usar para despertar y restaurar recuerdos que han quedado inactivos en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Él y sus colegas publicaron una investigación en la revista eLife en 2014 que indica que los recuerdos perdidos se pueden restaurar.

Hay muchos tipos de ARN y, en investigaciones futuras, Glanzman quiere identificar los tipos de ARN que se pueden usar para transferir recuerdos.


Extracción de ADN, ARN y proteínas: el pasado y el presente

La extracción de ADN, ARN y proteínas es el método básico utilizado en biología molecular. Estas biomoléculas se pueden aislar de cualquier material biológico para procesos posteriores posteriores, analíticos o preparativos. En el pasado, el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos solía ser complicado, lento, laborioso y limitado en términos de rendimiento general. Actualmente, existen muchos métodos especializados que se pueden utilizar para extraer biomoléculas puras, como protocolos basados ​​en soluciones y basados ​​en columnas. El método manual ciertamente ha recorrido un largo camino a lo largo del tiempo con varias ofertas comerciales que incluían kits completos que contienen la mayoría de los componentes necesarios para aislar el ácido nucleico, pero la mayoría de ellos requieren pasos de centrifugación repetidos, seguidos de la eliminación de los sobrenadantes según el tipo de muestra y tratamiento mecánico adicional. Los sistemas automatizados diseñados para laboratorios de tamaño mediano a grande han crecido en demanda en los últimos años. Es una alternativa a los métodos manuales que requieren mucha mano de obra. La tecnología debe permitir un alto rendimiento de muestras; el rendimiento, la pureza, la reproducibilidad y la escalabilidad de las biomoléculas, así como la velocidad, la precisión y la confiabilidad del ensayo deben ser máximas, al tiempo que se minimiza el riesgo de contaminación cruzada.


Resultados

Integridad del ARN almacenado

Analizamos la integridad de las muestras de ARN almacenadas por número de RIN Agilent 2100. Se analizaron alícuotas apareadas congeladas y desecadas de muestras de ARN humano total cada dos meses (excepto a los 10 meses) durante un año de almacenamiento total. La integridad de las muestras de ARN que se congelaron a -80 ° C se mantuvo constante, con puntuaciones RIN promedio que oscilan entre 8,8 y 9,1. Se encontró que la integridad de las muestras de ARN que se desecaron y luego se almacenaron a temperatura ambiente mantenían valores promedio de RIN de entre 8,7 y 9,1 en los cinco puntos de tiempo probados (Figura 1A, B). La mayor discrepancia en el valor de RIN entre dos muestras pareadas fue de 0,8, con la muestra de RNA desecada SQ 146 con una puntuación de RIN 0,8 más baja que su contraparte congelada en el mes dos y el mes cuatro de almacenamiento. La diferencia promedio entre los valores de RIN de las muestras apareadas desecadas y congeladas fue 0.2 con muestras congeladas que tienen los valores promedio de RIN ligeramente más altos (Figura 1B).

(A) Análisis electroforético de RIN de la integridad del ARN de dos muestras de ARN representativas que se desecaron y almacenaron a temperatura ambiente (D) o se congelaron a -80 ° C (F) durante 12 meses. Las muestras desecadas se muestran a la izquierda y las muestras congeladas se muestran a la derecha. Los dos picos principales de cada electroferograma son representativos de los fragmentos de ARN ribosómico 18S y 28S. (B) Los valores promedio de RIN con error estándar de la media de todas las muestras de ARN medidas después del número dado de meses de almacenamiento en un estado desecado (D) o congelado (F).

Validación RT-qPCR de ARN desecado a largo plazo

Después de dos, seis y 12 meses de almacenamiento, se analizaron hasta 10 muestras de ARN de pacientes de alícuotas congeladas y desecadas. En los puntos de tiempo de dos y seis meses, la mayoría de las muestras desecadas analizadas expresaron TBP en niveles cercanos o superiores a la expresión de TBP a partir de la alícuota de ARN congelada emparejada con la fuente. Desecado a congelado TBP las proporciones de expresión de uno indican una expresión equivalente de TBP en las alícuotas congeladas y desecadas, y las proporciones superiores a uno indican que hay mayores TBP niveles de mensaje en las alícuotas desecadas. El promedio del relativo TBP Se encontró que las proporciones de expresión de las muestras apareadas desecadas a congeladas eran superiores a uno después de dos y seis meses de almacenamiento. Después de un año de almacenamiento, se analizaron cinco muestras pareadas de ARN desecadas y congeladas y solo una fuente de ARN tenía un TBP Relación de expresión desecada / congelada por encima de uno, pero el promedio de estas cinco relaciones todavía estaba dentro de la mitad de un error estándar de la media a un valor de uno (Figura 2).

Las muestras de ARN almacenadas se analizan después de dos, seis y 12 meses mediante RT-qPCR durante un año. Los valores representados son TBP niveles de expresión en cada muestra desecada en relación con su alícuota congelada emparejada. Las barras de error representan el error estándar de la media entre las relaciones pareadas en cada punto de tiempo.

Durante el estudio de un año el Ct valores para qPCR TBP la amplificación generalmente aumentó en todas las muestras a medida que aumentaba el tiempo de almacenamiento. C promediot Los valores de alícuotas desecadas y congeladas de cinco muestras en cada punto de tiempo (cuatro en el punto de tiempo de dos meses) se muestran en Cuadro S1. Se encontró que todas las muestras de ARN, congeladas o desecadas, tenían una C más altat valor después de 12 meses de almacenamiento en comparación con después de dos meses de almacenamiento. Desde el punto de control de dos meses hasta el punto de control del año, el Ct El valor de las muestras de ARN desecadas aumentó en promedio en 2.85 ciclos, mientras que las muestras congeladas correspondientes mostraron un aumento de 1.85 ciclos (Cuadro S1). La tendencia de aumentar Ct el número no se mantuvo para cada muestra, ya que se observaron valores fluctuantes en las muestras de ARN durante el estudio de un año. Todo Ct Los valores de las muestras congeladas y desecadas se mantuvieron dentro del rango de los 20 segundos superiores a la mitad de los 30 segundos en los números de ciclo que representan valores positivos. TBP expresión.

A continuación, se realizaron experimentos de validación de qPCR utilizando tres conjuntos de cebadores / sondas adicionales del Conjunto Universal ProbeLibrary de Roche Applied Sciences. Se analizó el ADNc del ARN que se almacenó desecado o congelado durante 12 meses para determinar la expresión relativa de ACTB, GAPD y GUSB mensaje además de TBP. Los promedios relativos de la relación de niveles de expresión de ARN desecado a congelado fueron muy consistentes en los cuatro genes después de un año de almacenamiento (Figura S1), y los valores atípicos de relación alta y baja también fueron consistentes en los cuatro genes probados.

Análisis de secuenciación de ARN de ARN almacenado

El ARN total se extrajo de dos muestras de sangre humana. Cada muestra fue analizada por RNA-Seq sin almacenamiento (HD6, MB2026), después de 76 días de almacenamiento desecada a temperatura ambiente (HD6D, MB2026D) o después de haber sido congelada a -80 ° C (HD6F, MB2026F). Casi el 97% de todas las etiquetas de secuencia de alícuotas de ARN frescas, congeladas y desecadas de ambas muestras podrían mapearse en HG19 (tabla 1). figura 3 ilustra los gráficos de comparación de expresión génica por pares para los diferentes métodos de almacenamiento en estas dos muestras. A partir de estas comparaciones de expresión génica, el ARN extraído de muestras frescas (HD6 y MB2026) y comparado con el desecado (HD6D, MB2026D) o congelado (HD6F y MB2026F) compartió un alto grado de correlaciones (R 2 = 0,93) (Figura S2). Además, las expresiones génicas obtenidas de los métodos desecado (HD6D, MB2026D) y congelado (HD6F y MB2026F) son casi idénticas (R 2 = 0,997 y 0,999) (Fig. 3). Esto indica que el ARN almacenado en un estado desecado mantuvo los mismos perfiles de expresión génica que el ARN almacenado en el método congelado tradicional.


Cómo funciona RNAi

El término Interferencia de ARN (ARNi) se acuñó para describir un mecanismo celular que utiliza la propia secuencia de ADN del gen del gen para desactivarlo, un proceso que los investigadores denominan silenciar. En una amplia variedad de organismos, incluidos animales, plantas y hongos, el ARNi se desencadena por el ARN bicatenario (dsRNA).

Durante el ARNi, el ARNdc largo se corta o se "corta en cubitos" en pequeños fragmentos.

21 nucleótidos de largo por una enzima llamada "Dicer". Estos pequeños fragmentos, denominados pequeños ARN de interferencia (ARNip), se unen a proteínas de una familia especial: las proteínas Argonaute. Después de unirse a una proteína Argonaute, se elimina una hebra del dsRNA, dejando la hebra restante disponible para unirse a las secuencias diana del ARN mensajero de acuerdo con las reglas del emparejamiento de bases: A se une a U, G se une a C y viceversa. Una vez unida, la proteína Argonaute puede escindir el ARN mensajero, destruirlo o reclutar factores accesorios para regular la secuencia objetivo de otras formas.

Los investigadores utilizan ampliamente el ARNi para silenciar genes con el fin de aprender algo sobre su función. Los ARNip se pueden diseñar para que coincidan con cualquier gen, se pueden fabricar de forma económica y se pueden administrar fácilmente a las células. Ahora se puede ordenar ARNip sintetizados comercialmente para silenciar virtualmente cualquier gen en una célula humana o de otro organismo, acelerando dramáticamente el ritmo de la investigación biomédica. Además, la capacidad de desactivar la expresión de un solo gen convierte al ARNi en un enfoque terapéutico atractivo para tratar enfermedades infecciosas o trastornos genéticos, como los que resultan de la actividad inapropiada e indeseable de un gen, como en muchos cánceres y enfermedades neurodegenerativas. Actualmente hay varios ensayos clínicos que prueban la seguridad y eficacia de los medicamentos de ARNip.

RNAi es mucho más que una herramienta de investigación. El ARNi abarca una serie de mecanismos celulares antiguos y sofisticados que regulan una variedad de funciones biológicas. Las proteínas argonauta se unen a muchos ARN pequeños de origen natural para defenderse de los elementos transponibles, mantener la estructura y estabilidad de los cromosomas y regular el tiempo y la diferenciación del desarrollo. Por ejemplo, los microARN representan una forma natural de ARNip importantes para el desarrollo. Al igual que los ARNip, los microARN son producidos por Dicer, pero los microARN se derivan de ARN monocatenarios que se pliegan sobre sí mismos para generar pequeñas regiones de ARN bicatenario, los llamados "bucles madre", en lugar del ARN bicatenario largo que produce ARNip. Los microARN pueden guiar a las proteínas Argonaute a reprimir los ARN mensajeros que coinciden con el miARN de manera incompleta, lo que permite que un microARN regule cientos de genes. Los seres humanos producen más de 500 microARN distintos y la producción inapropiada de microARN específicos se ha relacionado con varias enfermedades. Actualmente se están probando medicamentos para inhibir los microARN que causan enfermedades como terapias para varias enfermedades humanas.


¿Qué es el ARN?

Dejemos que & rsquos comience con lo básico. Ácido desoxirribonucleico (ADN) es una molécula con la que quizás ya estés familiarizado; contiene nuestro código genético, el plano de la vida. Esta molécula esencial es la base del "dogma central de la biología", o la secuencia de eventos necesarios para que la vida funcione. El ADN es una molécula larga, de doble hebra, formada por bases, ubicada en el núcleo celular y rsquos. El orden de estas bases determina el modelo genético, similar a la forma en que se usa el orden de las letras en el alfabeto para formar palabras. DNA & rsquos & lsquowords & rsquo tienen tres letras (o bases) de largo, y estas palabras codifican específicamente los genes, que en el lenguaje de la célula, es el modelo para la fabricación de proteínas.

Para leer estos planos, el ADN de doble hélice se descomprime para exponer las hebras individuales y una enzima las traduce en un mensaje intermedio móvil, llamado ácido ribonucleico (ARN). Este mensaje intermedio se llama ARN mensajero (ARNm) y lleva las instrucciones para producir proteínas. Luego, el ARNm se transporta fuera del núcleo, a la máquina molecular responsable de fabricar proteínas, el ribosoma. Aquí, el ribosoma traduce el ARNm usando otra palabra de tres letras, cada tres pares de bases designa un bloque de construcción específico llamado aminoácido (de los cuales hay 20) para crear una cadena polipeptídica que eventualmente se convertirá en una proteína. El ribosoma ensambla una proteína en tres pasos y ndash durante el inicio, el primer paso, el ARN de transferencia (ARNt) trae el aminoácido específico designado por el código de tres letras al ribosoma. En el segundo paso, elongación, cada aminoácido se conecta secuencialmente mediante enlaces peptídicos, formando una cadena polipeptídica. El orden de cada aminoácido es crucial para la funcionalidad de las proteínas futuras. Los errores al agregar un aminoácido pueden provocar enfermedades. Finalmente, durante la terminación, la cadena polipeptídica completa se libera del ribosoma y se pliega en su estado proteico final. Las proteínas son necesarias para la estructura, función y regulación de los tejidos y órganos del cuerpo, su funcionalidad es aparentemente infinita.

A lo largo de la segunda mitad del siglo XX, creímos que el papel principal del ARN y rsquos era intermediar entre el ADN y la proteína, como describimos anteriormente. Durante las últimas tres décadas, esas creencias arraigadas se han hecho añicos. Hemos sido testigos de descubrimientos asombrosos con respecto a la biología del ARN, muchos de los cuales provienen de nuestros propios laboratorios aquí en el RTI. En 1998, Andrew Fire y RTI & rsquos Craig Mello descubrió la interferencia de ARN (ARNi), en la que el ARN de doble hebra puede encontrar y desactivar genes específicos en función de ciertas secuencias (orden de las 'palabras'). ¡Por esto, ganaron el Premio Nobel en 2006! Para comprender más sobre RNAi y saber cómo estamos desarrollando esta herramienta en una plataforma terapéutica, consulte: ¿Qué es RNAi?

Esta es una página oficial de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts.

RNA Therapeutics Institute (RTI) y bull 368 Plantation St Worcester, Massachusetts 01605


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Antes de comenzar su trabajo, su laboratorio debe estar debidamente preparado para trabajar con ARN. Como se mencionó anteriormente, el ARN puede ser bastante frágil si se maneja mal y las ARNasas son notoriamente difíciles de eliminar. Hay cuatro factores a los que debe prestar atención al preparar su laboratorio: pH, temperatura, iones metálicos y RNasas.

1. Designe un área para la extracción de ARN: Esto resulta especialmente útil si trabaja en un laboratorio compartido. Tener solo una parte del laboratorio designada para la extracción y manipulación de ARN limita las fuentes de contaminación por ARNasa.

2. Utilice artículos de plástico desechables sin RNasa: La etiqueta del material de plástico debe indicar explícitamente que está "libre de RNasa". No asuma que algo está libre de ARNasa porque es estéril ya que la esterilización no elimina las ARNasas. Además, las puntas de pipeta utilizadas deben contener un filtro para evitar cualquier contaminación. (Nota: si desea utilizar cristalería, debe hornearse entre + 180 ° C y + 200 ° C durante al menos 4 horas. La esterilización en autoclave no eliminará las ARNasas).

3. Trate los artículos de plástico reutilizables con EDTA: Si tiene la intención de utilizar artículos de plástico reutilizables, debe remojarlos (2 horas, + 37 ° C) en NaOH 0,1 M / EDTA 1 mM (o etanol absoluto con SDS al 1%) para eliminar los iones metálicos. Luego enjuague con agua tratada con DEPC y caliente a + 100 ° C durante 15 minutos.

4. Reúna todo su equipo de laboratorio: Asegúrese de que todo el equipo que utilizará esté disponible y sea de fácil acceso. No querrá terminar luchando por una pipeta en mitad de la extracción.

5. Limpiar el laboratorio y el equipo: Asegúrese de limpiar todos los bancos, pipetas, etc. en el área de extracción de ARN con etanol al 100% o un agente inactivante de ARNasa comercial. Además, reserve todos los productos químicos utilizados en la extracción y el análisis de ARN para usarlos únicamente en aplicaciones de ARN.

6. Mantenga siempre la temperatura baja: Todas las muestras de ARN deben mantenerse a 0 - 4 ° C mientras se trabaja con ellas. Por eso es importante asegurarse de tener siempre hielo a mano antes de recolectar muestras o sacarlas del almacenamiento.


Secuenciación de ARN

La secuenciación de ARN (RNA-Seq) está revolucionando el estudio del transcriptoma. Una herramienta altamente sensible y precisa para medir la expresión en el transcriptoma, proporciona a los investigadores visibilidad de cambios no detectados previamente que ocurren en estados de enfermedad, en respuesta a terapias, bajo diferentes condiciones ambientales y en una amplia gama de otros diseños de estudios.

RNA-Seq permite a los investigadores detectar características nuevas y conocidas en un solo ensayo, lo que permite la detección de isoformas de transcripción, fusiones de genes, variantes de un solo nucleótido y otras características sin la limitación del conocimiento previo.

Impulsar el progreso con RNA-Seq

La secuenciación de ARN puede tener efectos de gran alcance en la investigación y la innovación, transformando nuestra comprensión del mundo que nos rodea.

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Beneficios de la secuenciación de ARN

RNA-Seq con secuenciación de próxima generación (NGS) es cada vez más el método elegido por los investigadores que estudian el transcriptoma. Ofrece numerosas ventajas sobre las matrices de expresión génica.

  • Un rango dinámico más amplio permite una medición más sensible y precisa de la expresión génica
  • No limitado por conocimientos previos: captura tanto características conocidas como nuevas
  • Se puede aplicar a cualquier especie, incluso si la secuencia de referencia no está disponible.
  • Un mejor valor, que a menudo ofrece ventajas a un precio por muestra comparable o inferior al de muchas matrices
La secuenciación de ARN potencia la transcriptómica

Descubra cómo RNA-Seq está avanzando en la investigación del transcriptoma en varios campos y cómo los estudios de regulación genética pueden proporcionar información complementaria.

Revisión de la publicación de secuenciación de ARN

RNA-Seq es, con mucho, el método NGS más citado. Esta colección contiene diagramas de protocolo, ventajas y desventajas, y publicaciones relacionadas revisadas por pares sobre varios métodos RNA-Seq con tecnología Illumina.

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¿Cómo puedo aplicar RNA-Seq?

Estudie la expresión génica y los cambios en el transcriptoma con cáncer RNA-Seq.

Analice las interacciones huésped-patógeno o las firmas del transcriptoma bacteriano con ARN microbiano-Seq.

Métodos clave de RNA-Seq
Secuenciación de ARNm

Cuantifique con sensibilidad y precisión la expresión génica, identifique isoformas nuevas y conocidas en el transcriptoma codificante, detecte fusiones génicas y mida la expresión específica de alelos.

Secuenciación de ARN dirigida

Analizar la expresión génica en un conjunto específico de genes de interés. La secuencia de ARN dirigida se puede lograr mediante enfoques de enriquecimiento o basados ​​en amplicones.

Secuencia de ARN de celda única y entrada ultrabaja

Utilice deep RNA-Seq para examinar las señales y el comportamiento de una célula en el contexto de su entorno circundante. Este método es ventajoso para los biólogos que estudian procesos como la diferenciación, la proliferación y la tumorigénesis.

Secuenciación de captura de exoma de ARN

Logre un análisis rentable del exoma de ARN mediante la captura específica de secuencia de las regiones codificantes del transcriptoma. Ideal para muestras de baja calidad o material de partida limitado.

Secuenciación de ARN total

Mida con precisión la abundancia de genes y transcripciones y detecte características nuevas y conocidas en las formas codificantes y múltiples de ARN no codificante.

Secuenciación de ARN pequeño

Aislar y secuenciar pequeñas especies de ARN, como microARN, para comprender el papel del ARN no codificante en el silenciamiento génico y la regulación postranscripcional de la expresión génica.

Perfilado de ribosomas

Secuenciar en profundidad fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas para obtener una vista completa de los ribosomas activos en una célula en un momento específico y predecir la abundancia de proteínas.

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Guía del comprador: flujos de trabajo sencillos de RNA-Seq

Evaluación de opciones para la secuenciación de ARN de próxima generación.

Información más profunda con RNA-Seq

La secuenciación de ARN proporciona conocimientos más profundos para investigaciones complejas. Vea cómo RNA-Seq está ayudando a este laboratorio a ir más allá de la expresión genética.

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Identificación del gen objetivo

Descubra los objetivos genéticos y las vías vinculadas a la enfermedad.

Preguntas frecuentes: análisis de datos RNA-Seq

Desmitificando el análisis de datos con respuestas a algunas de las preguntas más frecuentes.

Riesgo y respuesta del anfitrión de COVID-19

Las diferencias genéticas del hospedador y las respuestas individuales al virus SARS-CoV-2 influyen en la susceptibilidad y la gravedad de la enfermedad.

Para uso exclusivo en investigación

No debe usarse en procedimientos de diagnóstico excepto cuando se indique específicamente.

Tecnologías innovadoras

En Illumina, nuestro objetivo es aplicar tecnologías innovadoras al análisis de la variación y función genética, haciendo posibles estudios que ni siquiera eran imaginables hace tan solo unos años. Para nosotros es fundamental ofrecer soluciones innovadoras, flexibles y escalables para satisfacer las necesidades de nuestros clientes. Como empresa global que otorga un gran valor a las interacciones colaborativas, la entrega rápida de soluciones y la prestación del más alto nivel de calidad, nos esforzamos por afrontar este desafío. Las tecnologías innovadoras de secuenciación y matriz de Illumina están impulsando avances revolucionarios en la investigación de las ciencias de la vida, la genómica traslacional y del consumidor y el diagnóstico molecular.


Preguntas del examen sobre biología molecular | Biología

Respuesta: Esta hipótesis explica el patrón observado de degeneración en la tercera base de un codón. Según esta hipótesis, la tercera base puede sufrir con la primera base correspondiente en el anticodón. La importancia de la oscilación y la degeneración del código genético es que la célula no tiene que sintetizar un ARNt diferente para cada uno de los 61 codones de sentido. Un ejemplo simple es que solo se necesitan dos anticodones de ARNt diferentes para reconocer cuatro codones de glicina diferentes.

Q.2. ¿Qué es la secuencia Shine-Dalgarno? ¿En qué grupos de microorganismos se encuentra?

Respuesta: La secuencia de Shine-Dalgarno se encuentra antes de la secuencia de inicio del ARNm. Esta secuencia de nucleótidos permite que el ARNm se alinee con la subunidad ribosómica 30S de la célula bacteriana. Está aproximadamente 7 bases corriente arriba antes) hacia el extremo 5 & # 8216-P del codón de inicio AUG en el ARNm y es una secuencia consenso de polipurina AGGAGG y se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (Fig. 33.7). Se encuentra en células bacterianas y arqueales.

Q.3. ¿Qué significan los codones UGA, UAA y UAG en la traducción normal?

Respuesta: En traducción normal, significan codones & # 8220Stop & # 8221.

Q.4. ¿Por qué se dice que el código genético está degenerado?

Respuesta: Es porque más de un codón puede codificar el mismo aminoácido.

Q.5. ¿Cuántos codones de terminación o codones sin sentido hay?

Respuesta: También hay solo tres codones de terminación, llamados & # 8220 codones sin sentido & # 8221, ya que no codifican ningún aminoácido.

Q.6. El codón AGG normalmente codifica argine pero en la traducción alterada codifica stop. ¿Dónde ocurre?

Respuesta: Ocurre en las mitocondrias humanas.

Q.7. ¿Qué hay de extraño en los estudios realizados en el ADN mitocondrial (genoma de ADN circular de doble hebra) a medida que se avanza de eucariotas inferiores a superiores?

Respuesta: Mientras uno avanza de eucariotas inferiores a superiores, lo extraño en el genoma mitocondrial es que se vuelve más pequeño, por ejemplo, el ADN mitocondrial de levadura es cinco veces más grande que el de las mitocondrias humanas.

Q.8. ¿Qué ha permitido que un ARNt determinado a veces reconozca específicamente varios codones?

Respuesta: La oscilación del par de bases en el extremo 5 & # 8242 del anticodón permite que el ARNt dado reconozca varios codones.

Q.9. Todas las proteínas bacterianas recién sintetizadas comienzan (inician) con formilmetionina (puede abreviarse como fmet). ¿Cómo se elimina el grupo formilo del polipéptido fmet en las bacterias?

Respuesta: El grupo formilo a menudo se elimina de la formil-metionina por la enzima deformilasa dejando atrás la metionina como el primer aminoácido en la cadena polipeptídica.

Q.10. ¿Qué son los genes? Definir.

Respuesta: Un gen puede definirse como una secuencia de nucleótidos que especifica una cadena polipeptídica o secuencia de ARN particular o que regula la expresión de otros genes. Los genes que codifican proteínas se denominan genes estructurales o cistrones, mientras que los otros genes que tienen una función reguladora se denominan genes reguladores. Los genes reguladores actúan para controlar la expresión de genes estructurales. Los genes estructurales y reguladores constituyen colectivamente el genotipo que determina el fenotipo, es decir, características estructurales y funcionales observables.

Respuesta: Una secuencia de ADN que codifica uno o más genes estructurales (polipéptidos) de función relacionada y la secuencia de ADN que regula la expresión.

Q.12. ¿Qué controla la inducción y la represión?

Respuesta: Los genes reguladores que producen una proteína reguladora controlan la inducción (es decir, provocan un aumento en la velocidad de síntesis de una enzima) y la represión (es decir, el bloqueo de la expresión génica).

P.13. ¿Qué es el operón lac?

Respuesta: El operón lac significa operón lactosa, un operón que contiene genes que especifican proteínas involucradas en la utilización de (3 -galactósidos como lactosa. El operón lac se encuentra en Escherichia coli aproximadamente a (= aproximadamente) 8 minutos en el mapa cromosómico. tiene la estructura: promotor-operador lac Zr-lac Y-lac A. El gen lac Z codifica P-galactosidasa, lac Y codifica (3-galactósido permeasa y lac A codifica tiogalactósido transacetilasa (Fig. 33.8).

P.14. ¿Qué es la represión catabólica?

Respuesta: La represión de catabolitos es la represión de la transcripción de genes que codifican ciertos sistemas enzimáticos inducibles por glucosa u otras fuentes de carbono fácilmente utilizables.

Q.15. ¿Qué son los reguladores positivos (activadores) y los reguladores negativos (represores)? Describir.

Respuesta: Las bacterias poseen muchas enzimas cuya velocidad de síntesis depende de la disponibilidad de moléculas alimentarias externas. Estas moléculas externas, llamadas inductores y correpresores, generalmente determinan la velocidad de síntesis de enzimas controlando la síntesis de sus moldes de ARNm. Los inductores y correpresores actúan uniéndose a proteínas reguladoras denominadas activadores y represores.

Los activadores son reguladores positivos porque su presencia es necesaria para que se produzca la enzima regulada, mientras que los represores actúan como reguladores negativos porque su actividad reguladora es prevenir la síntesis de proteínas. Por tanto, cuando no hay lactosa, el represor del operón lac (operón lactosa) evita la síntesis de enzimas que metabolizan la lactosa. Sin embargo, al unirse a un inductor (una molécula relacionada con la lactosa), el represor pierde esta capacidad y permite la producción de enzimas. La proteína C del operón arabinosa, que es un activador, provoca la producción de enzimas arabinosa al unirse al inductor arabinosa.

P.16. ¿Qué es la secuencia palindrómica del ADN?

Respuesta: Literalmente, palíndromo es una palabra que se lee igual hacia atrás y hacia adelante. La secuencia palindrómica es una región de un ácido nucleico que contiene un par de secuencias repetidas invertidas. En una molécula de ADN de doble hebra, dicha región muestra simetría rotacional doble (díada) o simetría díada hipematada si las dos secuencias de IR están separadas por otra secuencia. Una secuencia palindrómica de doble hebra puede adoptar cualquiera de las dos posibles formaciones:

1. Una estructura lineal con enlaces de hidrógeno entre cadenas, por ejemplo,

2. Una estructura cruciforme en la que de dos hebras cada una forma horquillas mediante enlaces de hidrógeno entre hebras.

Q.17. ¿Quién descubrió que los rayos X inducen mutaciones?

Respuesta: Hermann Muller y L.J. Stadler descubrieron de forma independiente en 1927 que los rayos X inducen mutaciones.

Respuesta: Un cistrón es un gen según se define en términos de la PRUEBA CIS-TRANS, es decir, en una célula diploide o merocigoto en cualquiera de las dos secuencias homólogas en un ácido nucleico genético en el que dos mutaciones en trans no presentan complementación completa. Un cistrón también puede definirse como la unidad funcional de herencia genética, un segmento de ácido nucleico genético que codifica una cadena polipeptídica específica. El término cistrón también se ha utilizado como sinónimo de gen.

Respuesta: El término reconocimiento fue acuñado por S. Benzer. Según él, es una unidad de subdivisión genética más allá de la cual no se produce la recombinación.

Q.20. Defina un mutador o un gen mutador.

Respuesta: Un gen mutador o mutante se designa como must dentro del cual ciertas mutaciones causan un aumento en la tasa de mutación espontánea en otros genes, por ejemplo, las mutaciones de Escherichia coli en el gen que codifica la subunidad e de la ADN polimerasa III (alelos de ADN Q y mut D) pueden dan lugar a niveles extremadamente altos de mutaciones espontáneas. Los alelos mutantes pueden diferir del tipo salvaje, por ejemplo, en solo uno o dos cambios de aminoácidos en la subunidad ε. La mutación puede conducir a una precisión reducida en la actividad de polimerización (selección de nucleótidos) o en la actividad de corrección de pruebas de la enzima. Algunos otros genes mutantes en E. Coli se incluyen en el sistema de reparación de desajustes.

Q.21. ¿Qué son los genes divididos? Describir.

Respuesta: Los genes divididos pueden definirse como los genes codificados por segmentos no contiguos del ADN, de modo que el ARNm y el ADN del producto proteico de ese gen no son colineales. Estos son los genes con secuencias de nucleótidos intermedios que no participan en la codificación del producto génico.

Los genes divididos también se han considerado genes interrumpidos. Un gen estructural que codifica una proteína, ARNr o ARNt que contiene demasiadas secuencias intermedias (intrones) que, aunque están representadas en la transcripción del ARN primario del gen, están ausentes de la molécula de ARN madura (ARNm, ARNt), por lo tanto, no contribuyen a la estructura del producto génico.

Por tanto, la mutación de la transcripción de ARN de un gen dividido debe implicar un proceso de corte y empalme para eliminar el intrón y unir las secuencias restantes llamadas exones. En el caso del ARNm, la secuencia de exones incluye la secuencia codificante del gen así como las secuencias líder y / o rastrera no codificantes. Los propios intrones no suelen codificarse. La mayoría de los genes estructurales nucleares en eucariotas superiores son genes divididos.

Q.22. ¿Qué son los genes superpuestos?

Respuesta: Los genes superpuestos son dos o más genes en los que una parte o un gen completo es coextensivo con parte de otro. Los genes pueden traducirse en diferentes marcos de lectura o en el mismo marco de lectura con diferentes puntos de inicio y / o parada o diferentes patrones de empalme. El fenómeno de superposición de genes maximiza la capacidad de codificación de un genoma y también puede proporcionar un medio para la regulación de la expresión de genes.

Q.23. La historia del mundo del ADN está escrita en secuencias de genes. Justifica esta afirmación.

Respuesta: La evolución de los organismos a partir de un ancestro común está representada por una vía ramificada conocida como árbol geológico (también conocido como árbol filogenético o evolutivo). El patrón de ramificación del árbol se calcula utilizando el principio de parsimonia (basado en la economía) para determinar el número mínimo de cambios genéticos necesarios para derivar la secuencia del gen en cada organismo a partir de un ancestro común. A veces es razonable suponer que proteínas altamente conservadas como la globina y el citocorme c pueden usarse como un reloj molecular para medir cuánto tiempo han estado divergiendo las especies entre sí.


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NAsafe está salando todos los medios de proteínas de sulfato de amonio (la concentración de saturación) con pH & lt 5 (ver la serie liotrópica).

La descripcion de NAsafe (4 M (NH4)2ASI QUE4, EDTA 10 mM, Mes 0,1 M, pH 4,6):
combinar 40 ml de EDTA 0,5 M, 19,5 g de ácido libre Mes, 528 g de sulfato de amonio, disolver en agua Milli-Q, llevar al volumen final 1 L, agitar en un agitador de placa caliente a fuego lento hasta que el sulfato de amonio se disuelva por completo. Transfiera a una botella con tapa de rosca y almacene a temperatura ambiente o refrigerada.

Almacene la solución NAsafe a temperatura ambiente. Tiene una garantía de 6 meses a partir de la fecha de recepción, si se almacena correctamente. Si se observa alguna precipitación de la solución NAsafe, caliéntela a 37 ° C y agite para volver a disolverla.

La inactivación de RNasa es reversible. No enjuague la solución NAsafe de las muestras antes de usarlas. Seque los tejidos con una toallita o sedimente las células para eliminar el exceso de solución NAsafe.

Directrices para el uso de NAsafe solución
y uso de toros NAsafe solución con tejido fresco solamente no congele los tejidos antes de la inmersión en NAsafe solución.
& toro Antes de la inmersión en NAsafe solución, corte muestras de tejido grandes a & le 0,5 cm en cualquier dimensión.
& toro Coloque el tejido fresco en 5 & ndash10 volúmenes de NAsafe solución.
& toro La mayoría de las muestras en NAsafe solution can be stored at room temp for 1 week without compromising RNA quality, or at &ndash20°C or &ndash80°C indefinitely.
&bull Do not freeze samples in NAsafe solution immediately store at 4°C overnight (to allow the solution to thoroughly penetrate the tissue), remove supernatant, then move to &ndash20°C or &ndash80°C for long-term storage.

Most samples can be stored at 25°C in NAsafe solution for up to 1 week without significant loss of RNA quality. After 2 weeks at 25°C, RNA generally appears slightly degraded (marginally acceptable for Northern analysis, but still of sufficient quality for nuclease protection assays or RT-PCR analysis).

The lyotropic series salts
Some anions and cations have been noted to be effective in the order of salting-out to salting-in effect:

NUEVA HAMPSHIRE4 + > Na + > K + > Li + > Rb + > Cs + > H + > Mg 2+ > Ca 2+ > Urea > [CH6norte3] + (guanidine)

OH - > SO4 -2 > HPO4 -2 > F - > citrate -3 > tartrate -2 > CH3COO - > Cl - > Br - > NO -3 > SCN - > ClO4 - > I -

These series known as lyotropic or Hofmeister series were related to a special physicochemical property of the ion called &ldquolyotropy&rdquo. Ions on the left such as strongly hydrated but weakly lyotropic anions of SO4 -2 are called kosmotropes, while the weakly hydrated ions, such as lyotropic anions of ClO4 - are referred to chaotropes.

(NH4)2ASI QUE4 and Na2ASI QUE4 is showing the greatest effect on the salting-out (precipitation) of proteins guanidinium thiocyanate is showing the greatest effect on the salting-in (chaotropic agent and denaturant) of proteins.

Guanidinium salts and urea are strong chaotropic salts that disrupt the structure of water and thus tend to decrease the strength of hydrophobic interactions resulting in a drastic effect on other solute molecules. For example, urea, when dissolved in water, disrupts the secondary, tertiary, and quatemary structures of proteins, and subsequently causes dissociation of proteins from RNA. Guanidinium salts and urea dissolve in water through endothermic reactions. Both guanidinium salts and urea are considered to be strongly chaotropic salts as defined by the Hofmeister series, a widely used system that ranks cations and anions according to relative chaotropic strength.

It has been believed both experimentally and theoretically that the effectiveness is more pronounced for anions than cations, which is classically used to describe the capacity of an ion to enhance or weaken the hydrogen-bond structure of water molecules, or, in other words, to enhance or reduce the solubility of a solute, respectively.

The overall salt effect depends on the nature of salts, surface, substrate, temperature and concentration. Although salt effects are very complex and quite different in different systems, lyotropic salts can be employed to shed light on the presence of molecular interactions in polymer systems.

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