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¿Podemos diluir PureExpress Cell Free Mix para aumentar el número de reacciones?

¿Podemos diluir PureExpress Cell Free Mix para aumentar el número de reacciones?



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Dado que la mezcla PureExpress Cell Free es tan cara, me preguntaba si sería posible simplemente diluir la mezcla para aumentar la cantidad de reacciones que necesitamos usar.

De esta imagen encontré:

Parece que con solo agregar más 3PGA, aminoácidos, deberíamos poder obtener más reacciones de una solución diluida. Según tengo entendido, esto significaría que el 3PGA y los aminoácidos son los únicos consumibles aquí. La dilución solo cambiaría la cantidad de tiempo que tarda en ocurrir la reacción o hay algo más que me falta aquí.


Intenta usar esto algo equivalente que puedes hacer tú mismo en el laboratorio por mucho más barato. El protocolo es un dolor de cabeza, lo he hecho yo mismo varias veces y se necesitan 2 personas trabajando en conjunto durante una semana larga, pero funciona. (El primer autor de este artículo ha creado una empresa exitosa basada en este sistema exacto sin células, Sutro BioPharma) https://www.jove.com/t/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia -basado en coli-tx-tl-libre de células

Si estás en una institución académica y estás interesado en probar esto, puedo explicarte algunas modificaciones que lo hacen más eficiente y qué partes tienen cierto margen de maniobra.

No recomendaría diluir PURExpress ... Todos los componentes de las reacciones sin células son esenciales y están cuidadosamente calibrados. La modificación de cualquiera de ellos puede resultar en una reducción drástica de la eficiencia. Por ejemplo, ¿podría ajustar todas las concentraciones de iones a medida que diluye la mezcla?

Recomiendo utilizar volúmenes mínimos de 5 µL en una placa de 384 pocillos.

también buena suerte comprando 3pga ... hubo una escasez masiva durante al menos un año cuando estaba haciendo estas cosas ... tal vez sea mejor ahora.


El sistema PURExpress de NEB es increíblemente caro, por esta razón lo he evitado todos los costes durante mis experimentos con sistemas sin células.

Este es el documento que he utilizado para crear mis propios sistemas sin células más baratos y al mismo tiempo discutir las razones por las que no se recomienda el uso del sistema NEB PURExpress: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00427

  • "Aunque NEB proporciona algunas formulaciones diferentes del sistema PURE, el usuario no puede personalizar ni optimizar el sistema comercial, y la formulación precisa del sistema PURE comercial no está disponible públicamente".

Esto podría responder a su pregunta de por qué no diluiría el sistema PURExpress ya que la formulación precisa no se conoce públicamente. Por lo tanto, podemos plantear la hipótesis de qué funcionaría en varias concentraciones, pero al final del día se desconoce qué usan específicamente en esta reacción y cómo se podría optimizar para sus propios fines. Se necesitaría un poco de prueba y error si realmente quisiera diluir / cambiar la formulación.

  • "Nuestro método cocultiva e induce los 36 clones de E. coli productores de proteínas en un solo matraz seguido de una sola purificación de Ni-NTA".

Este es el método que utilizo personalmente y puede llevar mucho tiempo, sin embargo, la recompensa es el costo y la capacidad de optimizar su sistema para su experimento específico.

  • "El sistema PURE consta de varios componentes diferentes [7], que pueden dividirse en tres categorías principales: proteínas (transcripción, traducción y regeneración de energía), ribosomas y componentes de moléculas pequeñas (sales, tampones, NTP, fosfato de creatina y ácido folínico)

Si tuviera que seguir la ruta de la dilución, le sugiero que se comunique con NEB de antemano para recibir consultas para los fines de su experimento y cualquier consumible que también pueda necesitar comprar. Esta cita del documento muestra cómo su sistema tiene muchas consideraciones para los consumibles, es posible que deba investigar más para maximizar la expresión de ciertas proteínas. En cuanto a cómo esto afecta el tiempo de reacción, la dilución no debería afectar el tiempo, sin embargo, afectará la cantidad de producto que obtiene de su reacción.


Intente usar el teorema de la compresión. Como todo es positivo, ya estás a mitad de camino, es decir, si el límite existe, sabemos $ 0 le lim _ <(x, y) to (0,0)> frac<| x | +3 | y |> $

Para la otra dirección, divide la fracción en dos partes e intenta usar la desigualdad:

Una desigualdad similar funcionará para la parte $ y ^ 4 $ de la fracción.

Elegimos la norma uno: $ || (x, y) || = | x | + | y ​​| $ y tenemos

Hay formas más apropiadas, pero usemos el martillo común. Sea $ x = r cos theta $ y $ y = r sin theta $. Sustituir. El único otro hecho necesario es que $ | sin theta | + | cos theta | $ está acotado por debajo. Un límite inferior fácil es $ frac <1> < sqrt <2>> $.

Cuando sustituye $ x $ y $ y $ en la parte superior, obtiene un término $ r ^ 2 $, parte del cual cancela el $ r $ en la parte inferior y la otra parte elimina la nueva parte superior como $ r a 0 $.


Una función holomórfica acotada $ f $ en un disco con $ f (0) = 0 $, que sugiere el lema de Schwarz.

Necesitamos adaptar ligeramente $ f $ para obtener una función a la que podamos aplicar directamente el lema. Necesitamos escalar el resultado para que se encuentre en el disco unitario, y el argumento para que el disco unitario se asigne al dominio de $ f $, aquí miramos

Las premisas se traducen en $ lvert g (z) rvert leqslant 1 $ para $ lvert z rvert leqslant 1 $, y $ g (0) = 0 $. Según el principio máximo, se deduce que $ g ( mathbb) subconjunto mathbbPS Ahora, el lema de Schwarz dice que $ lvert g (z) rvert leqslant lvert z rvert $ para todos $ z in mathbb$, y si hay igualdad para cualquier $ z in mathbb setminus 0 $, luego $ g (z) = c cdot z $ con $ lvert c rvert = 1 $. Siguen las afirmaciones sobre $ f $.


1. INTRODUCCIÓN

La síntesis de proteínas sin células (CFPS) surgió por primera vez en la década de 1960 como parte de una investigación que descubrió el código genético. 1 Posteriormente, este método de producción in vitro se ha adaptado para producir una variedad de productos que incluyen anticuerpos, péptidos bioterapéuticos, proteínas de fusión, candidatos a vacunas, proteínas de membrana, proteínas tóxicas y bacteriófagos. 2 En términos generales, existen dos tipos de CFPS: CFPS reconstituido y CFPS lisado crudo. En CFPS reconstituido, también conocido como el sistema de síntesis de proteínas mediante el uso de elementos recombinantes (PURE), las proteínas recombinantes purificadas y los ribosomas se agregan a la reacción en un enfoque ascendente. 3 En CFPS de lisado crudo, se utiliza un enfoque de arriba hacia abajo en el que las células se lisan y el extracto se clarifica. En ambos sistemas, este extracto se combina luego con una mezcla de reacción concentrada que contiene nucleótidos, aminoácidos, sustratos energéticos, sales, agentes de aglomeración molecular, polimerasas y material genético para la expresión del producto de interés. Se han generado extractos de células a partir de una variedad de organismos hospedadores: arqueas, E. coli, levadura como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, células de mamíferos como ovario de hámster chino, HEK293 y HeLa, germen de trigo y tabaco. 4-6 En este estudio, usamos E. colibasado en CFPS además de ser una de las opciones más económicas, es el extracto celular mejor estudiado con decenas de publicaciones hasta la fecha y varios kits comerciales disponibles en el mercado.

La transcripción y traducción están más simplificadas en las reacciones CFPS porque los recursos energéticos ya no necesitan usarse para mantener la actividad metabólica para el crecimiento celular, aunque la tasa de síntesis de proteínas es 200 veces más lenta que la tasa in vivo. 7 Las reacciones son mucho más breves que las de los cultivos in vivo, y suelen tardar solo unas pocas horas. Se han alcanzado títulos de 2,3 mg / ml deGFP con un E. coli-sistema CFPS basado en modo por lotes en 10 hr. 8 Además, debido a la ausencia de células compartimentadas, las reacciones de CFPS están abiertas a componentes adicionales, como acompañantes y detergentes, que pueden complementarse fácilmente en la reacción para ayudar en el plegamiento de proteínas y las modificaciones postraduccionales. 9, 10 Cuando se combina con ARN de transferencia ortogonal, el factor de elongación Tu y E. coli cepas en las que se ha eliminado el factor de liberación 1, este entorno abierto permite la incorporación de aminoácidos no naturales manteniendo altos títulos de proteína. 11 Se han utilizado varios formatos diferentes para la reacción de CFPS, incluidos dispositivos de microfluidos por lotes, lotes alimentados y reacciones de intercambio continuo. 12-15 Se ha demostrado que estas reacciones se escalan linealmente en modo discontinuo desde la escala de submililitros hasta 100 L, una característica deseable tanto para la ampliación como para la reducción de las reacciones. 12 Actualmente, Sutro Biopharma Inc. utiliza CFPS para fabricar un conjugado de anticuerpo y fármaco con un aminoácido no natural para permitir la conjugación dirigida a un sitio específico en el que el producto se encuentra actualmente en ensayos clínicos. 16 El trabajo reciente sobre reacciones de CFPS liofilizadas ha dado como resultado el desarrollo de tecnologías de "solo agregar agua", bioensayos portátiles, sensores ambientales y sensores basados ​​en papel. 17, 18 Las reacciones de CFPS también se han utilizado para la ingeniería metabólica y para observar los circuitos de genes. 18, 19

Aunque CFPS tiene muchas ventajas y aplicaciones, se ha trabajado poco en el desarrollo de procesos para estas reacciones. Las estrategias actuales de desarrollo de procesos para un biofarmacéutico típico en una célula huésped de mamífero implican esquemas de desarrollo de líneas celulares prolongados que pueden tardar entre 60 y 90 días. 20 Si bien este proceso puede ser más corto para huéspedes microbianos como E. coli y P. pastoris, sigue siendo engorroso y requiere clonación y selección de varias cepas. El hecho de que las reacciones de CFPS puedan producir buenos títulos en una escala de tiempo más corta y no requieran necesariamente ningún paso de clonación, ya que se pueden usar productos de PCR, permite el uso de metodologías de alto rendimiento para diseñar una estrategia de desarrollo de procesos. 21

Diseñamos una estrategia de desarrollo de procesos examinando el impacto de los parámetros del proceso, en particular la tensión del extracto celular, en el título del producto. Cierto E. coli las cepas que han sido diseñadas para tener un ARNm más estable o ARNt más eucariotas pueden resultar en una mejor traducción y mayores rendimientos para ciertos productos. De manera similar, hemos observado el impacto de la inducción en el título del producto en BL21 Star ™ (DE3) inducible por isopropil β-D-1-tioglatopiranósido (IPTG) E. coli células. Inducción de la E. coli Las células antes de la preparación del extracto deberían dar como resultado una mayor concentración de ARN polimerasa T7, una enzima vital para la transcripción. La adición de la ARN polimerasa de T7 a la reacción de CFPS se encuentra comúnmente en la literatura, ya que la ARN polimerasa de T7 es altamente selectiva para sus propias secuencias promotoras y tiene una tasa de transcripción más alta que la endógena. E. coli Polimerasa de ARN. 22

Debido a que las condiciones de reacción de CFPS ya no están limitadas por las necesidades de mantener células metabólicamente activas, los parámetros de reacción de CFPS pueden extenderse a extremos mayores que pueden ayudar en la síntesis de proteínas difíciles de expresar y procesos de autoensamblaje (p. Ej., Similares a virus partículas [VLP]). 23-25 ​​Añadiendo más de los componentes potencialmente limitantes, por ejemplo, ADN plasmídico o extracto celular, el equilibrio de la reacción puede cambiarse para aumentar el rendimiento del producto. Sin embargo, dado que tanto la preparación del plásmido como del extracto son procesos que requieren mucho tiempo y mano de obra, es fundamental que el sistema no utilice más de lo que se requiere para cualquiera de los componentes. Como las reacciones ya no están limitadas por el crecimiento celular, el pH de la mezcla de reacción concentrada se puede disminuir o aumentar mucho más allá de los niveles fisiológicos típicos. Sin embargo, llevar el pH de la reacción demasiado lejos puede tener un efecto adverso en las moléculas requeridas para la transcripción y traducción del producto (ribosomas, polimerasas, enzimas, etc.) o podría resultar en la precipitación de otros componentes de la reacción. Debido a que la tasa de elongación del polipéptido en E. coli las células se mejoran a temperaturas más altas, el aumento de la temperatura de reacción debería aumentar la producción, aunque un aumento excesivo puede conducir a la degradación de las proteínas. 26 Además, las temperaturas más bajas pueden ser beneficiosas ya que las reacciones de CFPS se consideran menos termoestables que sus correspondientes células huésped porque están más diluidas. Las temperaturas más bajas también pueden ayudar en el plegamiento de proteínas y prevenir la agregación. 27 La duración de la reacción debe ser lo suficientemente larga para permitir la expresión de títulos altos de proteína, pero no debe ser tan larga como para que inhibidores como el fosfato inorgánico saturen el sistema. 28

El trabajo presentado aquí investiga el impacto de los parámetros del proceso antes mencionados en el título del producto. Examinamos el E. coli cepa utilizada para el extracto celular, dos composiciones de la mezcla de reacción concentrada y selección de plásmidos. Usamos análisis de datos multivariados (MVDA) para generar un modelo basado en los títulos resultantes de reacciones donde el plásmido y la concentración de extracto celular, el pH de la mezcla de reacción concentrada, la temperatura de reacción y la duración de la reacción se manipularon individualmente. (Elegimos comparar dos mezclas de reacción concentradas en lugar de investigar los componentes individuales de las mezclas de reacción concentradas porque esto ya se ha examinado con cierta profundidad en otro lugar. 29, 30) Al realizar una regresión multilineal (MLR), predijimos qué combinación de parámetros dan como resultado los títulos más altos dentro del robusto espacio operativo definido. Los parámetros del proceso con la mayor influencia en el título se evaluaron más a fondo mediante un enfoque de diseño de superficie de respuesta de experimentos (DoE) que permitió identificar las condiciones operativas que llevaron a un aumento significativo en el título del producto. Varios otros grupos han usado DoE anteriormente para examinar múltiples parámetros a la vez mientras usaban una cantidad mínima de material de reacción para optimizar partes del sistema CFPS, incluida la preparación de extractos, las concentraciones de chaperona y sal para la expresión de proteínas con enlaces disulfuro y la proporción de pesados plásmido que expresa cadena a plásmido que expresa cadena ligera para expresión de anticuerpos. 12, 31-33 Aquí usamos DoE para la maximización de títulos en un espacio de diseño dado, en lugar de la optimización, para demostrar cómo esta estrategia de desarrollo de procesos podría usarse con dos proteínas diferentes.


Protocolo

  1. Descongele la cantidad necesaria de alícuotas de la solución A y la mezcla de factor en hielo. Pulsar-centrifugar en microcentrífuga para recoger las soluciones en el fondo del tubo.

Ciertos componentes de la Solución A pueden precipitar durante el almacenamiento. Asegúrese de mezclarlo bien antes de ensamblar las reacciones. El rendimiento del kit no se verá comprometido.

Estas formulaciones permiten un aumento en el volumen "agregado por el usuario" (para plantillas, suplementos, etc.) tolerando hasta un 20% sobre el volumen (30 & mul de reacción en total) sin una caída apreciable en la productividad.

La plantilla de control DHFR se suministra a 125 ng / & mul. Utilice 2 & mul para la reacción de control positivo. El ADN molde, particularmente el ADN plásmido preparado por mini-prep (por ejemplo, Qiagen) es a menudo la principal fuente de contaminación por ARNasa. Recomendamos encarecidamente agregar 20 unidades de inhibidor de ARNasa murina (NEB # M0314) en cada reacción.

Para las proteínas diana que requieren un enlace disulfuro, sugerimos complementar las reacciones con el potenciador del enlace disulfuro PURExpress (PDBE, NEB # E6820).

Agregue la Solución B a la Solución A, no diluya la Solución B sin tampón. Recomendamos una concentración inicial de 250 ng de ADN molde por reacción de 25 & mul. La cantidad óptima de ADN de entrada se puede determinar configurando múltiples reacciones y titulando la cantidad de ADN molde agregado a la reacción. Normalmente, la cantidad óptima estará en un rango de plantilla de 25-1000 ng. (NEB # E3313) La reacción estándar contiene 60 pmoles de ribosomas en una reacción de 25 & mul. Los ribosomas de control suministrados son suficientes para dos reacciones. Es posible utilizar una cantidad menor de ribosomas, pero la producción de proteínas puede ser menor.

Recomendamos utilizar una incubadora en lugar de un baño de agua para evitar la evaporación. Algunas reacciones pueden beneficiarse de una hora adicional de incubación para lograr el máximo rendimiento. Algunas proteínas también son más solubles a temperaturas reducidas, sin embargo, las reacciones de incubación por debajo de 37 ° C probablemente reducirán el rendimiento.

Algunos materiales pueden precipitar durante el almacenamiento a -20 ° C. Asegúrese de que todo se resuspende girando el tubo de reacción después de descongelarlo.

Los componentes PURExpress están altamente purificados y presentes en cantidades conocidas. La naturaleza reconstituida de este producto lo hace susceptible de modificaciones. Como tal, es fácil de realizar in vitro reacciones de etiquetado con 35 S-metionina para permitir la visualización del producto. También es sencillo complementar las reacciones con un componente en investigación que se cree que tiene un efecto sobre la transcripción o traducción. In vitro El marcaje con 35 S-metionina se puede realizar estableciendo una reacción estándar con la adición de 2 & mul de 35 S-metionina.

Todos los aminoácidos, incluida la metionina, están presentes en aproximadamente 0,3 mM en PURExpress. Los aminoácidos marcados competirán con los aminoácidos normales existentes y la señal observada del marcador depende de la eficacia de incorporación en la proteína de interés. Cuando se suplementa con 1,2 & muM 35 S-L-metionina, observamos niveles de incorporación compatibles con la detección autorradiográfica de la proteína sintetizada. Las reacciones (1 & ndash5 & mul) se pueden resolver directamente mediante SDS-PAGE (sin necesidad de precipitación con acetona), los geles se fijan brevemente en una solución de metanol / ácido acético (45% / 10%) durante 5 minutos a 25 ° C y se secan. sobre papel de filtro (2 horas a 80 ° C). A continuación, el gel seco se expone a una película autorradiográfica (durante la noche a -20 ° C) o se detecta con un fosforimager.


La secuenciación ATAC de celda única mediante indexación combinatoria (sciATAC-seq) permite la identificación de perfiles de accesibilidad de cromatina a resolución de celda única con un enfoque de código de barras dual durante la transposición y la construcción de la biblioteca. A diferencia de los enfoques comerciales basados ​​en gotas, sciATAC-seq es una estrategia rentable y extensible que permite flexibilidad en la escala experimental mediante códigos de barras multiplexados en muestras o perturbaciones. Por el contrario, los enfoques basados ​​en gotas tienen una mayor recuperación de células y pueden ser ventajosos cuando la entrada de células es limitada. El protocolo sciATAC-seq paso a paso descrito aquí es susceptible de diversos tipos de células y muestras fijas.

Para obtener detalles completos sobre el uso y la ejecución de este protocolo, consulte LaFave et al. (2020).


¿Podemos diluir PureExpress Cell Free Mix para aumentar el número de reacciones? - biología

La expresión de una proteína necesita la transcripción y traducción de genes. Si la transcripción de genes o la cantidad de transcripción de genes reflejan claramente el nivel de expresión de la proteína. Por lo tanto, es fundamental que la información de la expresión de proteínas detecte la cantidad de transcripción de genes diana. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR en tiempo real) es una técnica experimental común de biología molecular basada en la PCR.Esta tecnología cambia el diagnóstico molecular hacia una tecnología automatizada de alto rendimiento con menos tiempos de respuesta. La reacción de PCR genera copias de una plantilla de ADN de forma exponencial lo que hace que se pueda detectar la cantidad de plantilla. La qPCR en tiempo real es una detección confiable de productos generados durante cada ciclo del proceso de PCR.

La PCR es una técnica común para amplificar el ADN. Por lo tanto, primero necesitamos realizar una transcripción inversa del ARN aislado de las células al ADNc. Para amplificar un pequeño número de ADNc, la qPCR en tiempo real tiene un sistema de reacción homólogo con la PCR: una plantilla de ADNc, al menos un par de cebadores específicos, desoxirribonucleótidos, una solución tampón adecuada y una ADN polimerasa termoestable. Además de esta mezcla, se agrega una sustancia marcada con un fluoróforo para medir uno o más productos específicos. Agregue todo el sistema de reacción a un termociclador, se mide cada ciclo de PCR de la tasa de generación. Un ciclo de PCR consiste en una serie de cambios de temperatura, el proceso de Q-PCR generalmente se repite de 20 a 30 veces. Estos ciclos normalmente constan de tres etapas: (1) A una temperatura de aproximadamente 95 ° C, se separa la doble cadena de ácido nucleico. (2) Alrededor de 50-60 ℃, los cebadores se unen a las plantillas de ADN. (3) A una temperatura de alrededor de 68-72 ℃, la ADN polimerasa facilita la polimerización.

Hay varias químicas como sondas de qPCR en tiempo real disponibles: el agente intercalante de dsDNA (SYBR & reg Green 1), sondas de hidrólisis (TaqMan & reg), sondas de hibridación dual, sondas de escorpión de balizas moleculares, etc. Introducimos principalmente los principios de las dos primeras sondas, que son las más utilizadas.

(1) El agente intercalante de dsDNA SYBR & reg Green 1

SYBR & reg Green 1 es un tinte de unión a ADN fluorescente no específico que se intercala en dsDNA. SYBR & reg Green 1 emite poca fluorescencia cuando no está unido con dsDNA. Después del apareamiento y la polimerización del cebador, SYBR & reg Green 1 se intercala dentro del producto de dsDNA, lo que da como resultado un aumento de la fluorescencia detectada. La ventaja de SYBR & reg Green 1 es que es relativamente económico, ya que se puede utilizar con cualquier par de cebadores para cualquier objetivo. La principal desventaja de este método es que es un tinte no específico que se une a todos los dsDNA como los dímeros de cebadores y los productos de PCR no específicos. Por lo tanto, debemos comparar las curvas de fusión para aumentar la especificidad de la reacción.

(2) Sondas de hidrólisis (TaqMan & reg)

TaqMan & reg tiene un tinte reportero fluorescente adherido a su extremo 5 & rsquo y un tinte apagador en su extremo 3 & rsquo. El cebador y las sondas TaqMan se hibridan con la plantilla de ADN simultáneamente. Después de la fase de extensión, TaqMan fue escindido por la polimerasa de ADN, lo que da como resultado que el tinte indicador fluorescente del extremo 5 y rsquo de TaqMan se separa con el tinte extintor del extremo 3 y se detecta la fluorescencia.

(1) Línea de base: la línea de base es una línea crítica cuando se acumula una señal fluorescente informadora pero no alcanza los límites de detección del instrumento. El software de computadora establece la línea de base a partir de los ciclos 3

15 generalmente de acuerdo con los ciclos de PCR.

(2) △ ​​Rn : Rn = Rnf & ndash Rnb. Rnf es la emisión de fluorescencia del producto en cada momento. Rnb es la emisión de fluorescencia de la línea base. △ Rn es un valor dinámico basado en cada ciclo de PCR.

(3) Umbral: los programas informáticos eligen un umbral en función de la variabilidad de la línea de base. Se cree que una señal fluorescente que se detecta por encima del umbral es una señal real que puede usarse para definir el ciclo de umbral (Ct) de una muestra.

(4) Ct: el valor Ct es el número de PCR en el que la fluorescencia del indicador es mayor que el nivel de detección mínimo. Es un componente básico y esencial para el análisis de datos.

Los genes más comunes que se utilizan para los genes domésticos son la beta-actina, la GAPDH y el ARN ribosómico (ARNr).

4. Cuantificación absoluta y cuantificación relativa de amperios

La cuantificación de las muestras desconocidas se mide mediante el valor Ct y la curva estándar. El método más común es usar un plásmido para el gen diana y la curva estándar generada por una dilución en serie de una cantidad inicial. El método de la curva estándar se utiliza cuando la cuantificación absoluta es fundamental o en la cuantificación de la carga viral.

La cuantificación relativa también se conoce como el método de umbral comparativo (método 2- △△ Ct). Este método se utiliza para calcular los niveles de expresión relativos de un objetivo en relación con un control de referencia. La cantidad de gen diana dada por 2- △△ Ct en la muestra se normaliza a un gen de mantenimiento y en relación con el calibrador normalizado. △ Ct = Ct (gen objetivo) y ndash Ct (gen de mantenimiento), △△ Ct = △ Ct (muestra) - △ Ct (calibrador).

Cebadores de avance y retroceso: 10 y muM

Sondas de detección de blancos específicos

Puntas de pipeta con filtro estériles

Tubos de centrífuga estériles de 1,5 ml

MÉTODO (Específico para ensayos SYBR & reg Green)

Reacciones Concentración final objetivo Volumen por tubo
Agua libre de ARNasa variable 3,85 y muL
10 y veces TaqMan RT buffer 1 vez 1.0 y muL
25 mM de MgCl2 / td & gt 5,5 mM 2.2 y muL
dNTP (2,5 mM) 500 y muM por dNTP 2.0 y muL
Hexámeros aleatorios (50 y muM) 2.5 y muM 0,5 y muL
Inhibidor de ARNasa (20 U / L) 0,4 U / y muL 0,2 y muL
Transcriptasa inversa MultiScribeTM (50 U / y muL) 1,25 U / y muL 0,25 y muL
Total 10 y muL
Temperatura Tiempo
Incubación 25 ° C 10 minutos
RT 48 & grados 30 minutos
Inactivación de la transcripción inversa 95 ° C 5 minutos
Sostener 4 ° C & infin

(1) Prepare la mezcla de reacción RT combinando todos los componentes no enzimáticos.

(3) Agregue los componentes enzimáticos y el ARN.

(4) Mezcle los componentes invirtiendo el tubo de microcentrífuga.

(5) Transfiera el contenido a un tubo óptico o placas MicroAmp & reg.

(6) Tape los tubos o placas con tapas ópticas MicroAmp & reg.

(7) Centrifugue los tubos brevemente para eliminar las burbujas de aire y recoger el líquido en el fondo del tubo.

(8) Transfiera las placas al bloque del termociclador.

(10) Retire las placas una vez finalizado el ciclo térmico.

2. PCR cuantitativa en tiempo real

(1) Diseñar y sintetizar cebadores. Hay muchos programas informáticos de diseño de imprimaciones, como Oligo, PrimerPremier y DNA man. El amplicón para el producto de PCR debe ser tan pequeño como sea razonablemente posible, por lo general < 300 pb de longitud para los diseños. Los amplicones más cortos se amplifican de manera más eficiente y son más tolerantes a las condiciones de reacción. Los cebadores de PCR no deben formar una cantidad apreciable de bandas de cebador-dímero.

(2) Ponga todos los componentes de reacción en hielo para que se derrita, preste atención a colocar el tinte de la sonda de referencia para evitar la luz.

(3) Calcule el número de reacciones, incluidas las referencias internas, los controles sin plantillas (NTC) y las repeticiones. Diseña los lugares de diferentes reacciones.

(4) Prepare la mezcla de tintes de la sonda de referencia y la mezcla de cebadores de acuerdo con los diferentes números de reacción y sistemas de reacción (sistema de reacción de 20 ul).

(5) Agregue la dosis apropiada de 2 & timesPCR mix y 25 mM MgCl2 en la mezcla del paso 4. Prepare una mezcla maestra para todas las reacciones.

Mezcla maestra para reactivo qPCR en tiempo real con componentes separados:

Reacciones Concentración final objetivo Volumen por solo 15 y muL
2 y veces mezcla de PCR 1 vez 7.5 y muL
Imprimación directa (10 y muM) 0,2 y muM 0,3 y muL
Imprimación inversa (10 y muM) 0,2 y muM 0,3 y muL
MgCl2 25 mM 3,5 mM 2.6 y muL
Colorante de sonda de referencia X y muL
Agua de grado PCR Total 15 y muL

(6) Agregue 5 µl de agua a los pozos de reacción NTC. Asegúrese de que haya al menos dos pozos NCT.

(7) Agregue 5 uL de plantillas de ADN / ADNc a los pocillos apropiados con la misma concentración.

(8) Añada 15 ul de sonda, cebadores y mezcla maestra preparada en el paso 5 en los pocillos de reacción.

(9) Selle las placas de PCR de 96/384 pocillos con una película de plástico. Marque los diferentes pozos de reacción en la película. Asegúrese de que el marcador no afecte la detección del instrumento qPCR.

(10) Agite suavemente las placas de PCR para asegurarse de que los componentes se mezclen uniformemente.

(11) Centrifugue las placas de PCR brevemente y compruebe que todos los pocillos contienen muestras en el fondo de los pocillos.

(12) Ejecute muestras de acuerdo con los parámetros apropiados en el instrumento qPCR.

Parámetros de ciclismo estándar:

Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94 ° C 2 minutos
Desnaturalización 94 ° C 15 segundos 40 ciclos
Recocido 5 ° C por debajo de la imprimación más baja TM 1 minuto
Extensión y lectura de fluorescencia 72 & grados 1 min por kb
Sostener 4 ° C & infin

(13) Analice los datos del ciclo mediante el software de computadora Excel y SDS 2.4, etc. Preste atención a la curva de disolución y asegúrese de que solo haya un pico en cada pocillo.

△ Ct = Ct (gen diana) y ndash Ct (gen de mantenimiento)

△△ Ct = △ Ct (muestra) - △ Ct (calibrador)

El valor Ct se puede adoptar cuando la curva de disolución tiene un pico:

Línea de base configurada correctamente:

Línea de base establecida demasiado baja:

Línea de base establecida demasiado alta:

1. El ARN para la reacción de qPCR en tiempo real debe evitar la interfusión del ADN. Los procesos de extracción de ARN y transcripción inversa deben ser cautelosos.

2. El experimento de qPCR en tiempo real debe operarse en el hielo evitando la luz.

3. La plantilla de cDNA debe evitar la congelación y descongelación repetidas, de lo contrario provocará la degradación de la plantilla de cDNA.

4. La falta o degradación de la plantilla hace que los valores de CT no aparezcan o aparezcan demasiado tarde. La qPCR debe comenzar desde la concentración más alta de la serie de muestras diluidas para muestras de concentración desconocida.

5. La plantilla debe diluirse moderadamente antes de agregarse al sistema de reacción para mejorar la eficiencia de la amplificación. Pero la repetibilidad de los resultados empeora cuando la concentración de plantilla es demasiado baja.

6. Los fragmentos amplificados no deben ser demasiado largos, 80-300 pb es suficiente. La temperatura de recocido debe ser superior a 60 ℃. Preste atención para evitar los dímeros de los cebadores y la amplificación inespecífica.

7. Una concentración demasiado alta de cebadores o dímeros de cebadores hará que la curva de disolución aparezca en más de un pico principal.


El código de Matlab utilizado para generar datos extendidos Figs. 1, 2 y 3 se proporciona en la información complementaria.

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Conceptos básicos de secuenciación

La secuenciación fluorescente automatizada utiliza una variación del protocolo de terminación de cadena de Sanger desarrollado hace más de 20 años. En este método, el ADN que se va a secuenciar actúa como una molécula molde a la que se hibridará un oligonucleótido complementario corto (cebador) para comenzar la extensión enzimática y la amplificación de una región específica de ADN bicatenario. Los fragmentos recién creados serán complementarios a la plantilla de ADN. Este proceso tiene lugar durante la reacción de secuenciación del ciclo, un proceso al que debe someterse cada muestra que recibimos para poder amplificarse y etiquetarse con fluorescencia para su detección en nuestros secuenciadores.

En esta reacción de secuenciación del ciclo, la plantilla y el cebador se combinan junto con una mezcla de reacción compuesta de dNTP, ddNTP marcados con fluorescencia, enzima polimerasa Amplitaq FS y tampón. La reacción de secuenciación del ciclo se compone de tres pasos: desnaturalización, recocido y extensión, y se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento que permite el calentamiento y enfriamiento controlados de nuestras reacciones. Estos pasos se repiten durante 35 ciclos para asegurar una amplificación suficiente del ADN marcado, y tarda aproximadamente 3 1/2 horas en completarse.

Durante el paso de desnaturalización, que se produce a 96ºC, el ADN molde bicatenario se separa primero en moléculas monocatenarias. En la etapa de hibridación, la temperatura se reduce a 50ºC para que las pequeñas moléculas del cebador puedan encontrar sus regiones complementarias en el ADN molde, ahora monocatenario, e hibridar, o hibridar, correctamente. Luego, la temperatura se eleva a 60ºC (paso de extensión) para permitir que la enzima polimerasa Taq comience a incorporar nucleótidos en cadenas en crecimiento de fragmentos recién creados que son complementarios al ADN molde monocatenario. Estos productos de extensión comienzan al final de la imprimación y se extienden en la dirección de 3 '. La terminación de la cadena ocurre durante este paso de extensión. Nuestra mezcla de reacción contiene una mezcla de desoxinucleótidos (dNTP) y didesoxinucleótidos (ddNTP), en concentraciones que crean una probabilidad estadística de que se incorpore un didesoxinucleótido en lugar de un desoxinucleótido en cada posición de nucleótido en los fragmentos recién generados. Cuando se incorpora un dNTP, el nuevo fragmento seguirá creciendo.Un ddNTP contiene un átomo de hidrógeno en lugar de un grupo hidroxilo en su extremo 3 'y no puede participar en una extensión adicional. Por lo tanto, cuando se incorpora un ddNTP, se bloquea el alargamiento adicional de la cadena y esto da como resultado una población de productos truncados de longitudes variables.

Cuando se separan por electroforesis, se formará una "escalera" de estos productos truncados, cada uno con un tamaño diferente en un nucleótido, con los fragmentos terminados más pequeños corriendo más rápido en el gel. Hay cuatro ddNTP diferentes que corresponden a cada uno de los cuatro nucleótidos de ADN, y cada ddNTP tiene un color diferente. Por tanto, cada fragmento truncado contendrá un ddNTP marcado con fluorescencia en su extremo 3 ', y la escalera de secuenciación estará compuesta por bandas coloreadas. Luego, la secuencia se puede determinar correlacionando el color de una banda en el gel con su ddNTP específico y el orden en el que corrieron en el gel. Por tanto, la primera y más pequeña banda visualizada corresponderá al primer nucleótido marcado incorporado inmediatamente adyacente al cebador. La segunda banda serán los fragmentos que consisten en 1 dNTP sin marcar y 1 ddNTP marcado que terminaron esas cadenas de crecimiento particulares. La tercera banda estará formada por 2 dNTPS sin marcar seguidos de 1 ddNTP marcado, y así sucesivamente en el gel.

Una vez amplificada y etiquetada la muestra, se debe someter a electroforesis para la separación de los fragmentos marcados y su visualización. Como se mencionó anteriormente, los ddNTP están marcados con fluorescencia. Los colorantes adjuntos son colorantes de transferencia de energía y consisten en un colorante donador de energía de fluoresceína unido a un colorante de diclororodamina aceptor de energía. Este sistema de transferencia de energía es mucho más sensible que un sistema de un solo colorante y nos permite utilizar menos ADN para la detección y, además, nos permite ahora secuenciar moléculas de ADN muy grandes, como BAC, PAC e incluso algo de ADN genómico bacteriano, que anteriormente, los métodos menos sensibles no podían gestionar.

Estos fragmentos marcados con colorante se cargan en los secuenciadores y, durante la electroforesis, migran a través del gel de poliacrilamida o del polímero líquido y se separan en función de su tamaño. Hacia el final del gel o del capilar, pasan a través de una región que contiene una ventana de lectura, detrás de la cual un rayo láser pasa de un lado a otro detrás de las muestras migratorias. Este láser excita los tintes fluorescentes adheridos a los fragmentos y luego emiten luz a una longitud de onda específica para cada tinte. Esta luz emitida se separa según la longitud de onda mediante un espectrógrafo en un dispositivo refrigerado con carga acoplada o una cámara CCD, de modo que las cuatro emisiones fluorescentes se pueden detectar con una pasada de láser. El software de recopilación de datos recopila estas intensidades de luz de la cámara CCD en bandas de longitud de onda particulares, o filtros virtuales, y las almacena en la computadora del secuenciador como señales digitales para su procesamiento. El software de análisis luego interpreta la intensidad fluorescente en cada punto de datos y asigna sus interpretaciones de llamada base.

Instrumentación en nuestro laboratorio

El laboratorio de secuenciación de ADN de Roswell Park utiliza actualmente dos analizadores genéticos ABI PRISM 3130XL. Son secuenciadores de ADN capilar automatizados fabricados por Applied Biosystems. Cada 3130 usa una matriz de 16 capilares, que puede procesar 176 muestras en 24 horas usando nuestra configuración actual o hasta 384 muestras en 24 horas con un protocolo que brinda longitudes de lectura más cortas, pero permite un rendimiento máximo.

Con el 3130, la carga de la muestra se basa en la inyección electrocinética. Cuando se coloca una placa de muestras en la plataforma de carga del instrumento, la matriz de 16 capilares se sumerge en los primeros dieciséis pocillos de muestra, se aplica voltaje e iones cargados negativamente, que son principalmente los productos de extensión del ADN pero que también pueden incluir sustancias interferentes como sales, se inyectan en la matriz capilar. Esta es una de las razones por las que el ADN debe estar especialmente limpio para las ejecuciones en el 3130, ya que los iones más pequeños cargados negativamente, como las sales, se inyectan preferentemente y pueden interferir con la migración de los fragmentos de ADN.

Un polímero que fluye líquido pasa a través de los 16 capilares de la matriz para actuar como matriz de separación. Se empuja una alícuota nueva de polímero en los capilares antes de cada ciclo, eliminando el polímero del ciclo anterior. Anteriormente, nuestro laboratorio utilizaba la matriz capilar más larga proporcionada para el 3100, de 80 cm de longitud, y el polímero POP-4 de Applied Biosystems para el medio de separación. Esta combinación dio alrededor de 900 bases de secuencia útil, y los datos de dieciséis muestras se pudieron adquirir en 3 horas y 40 minutos con esta matriz y polímero. Sin embargo, desde entonces hemos desarrollado protocolos de ejecución modificados que utilizan el polímero más nuevo de Applied Biosystems, POP-7, y una matriz de 50 cm. Este polímero se desarrolló específicamente para el secuenciador de alto rendimiento de ABI (el modelo 3730) y se ha demostrado que proporciona longitudes de lectura más largas junto con tiempos de ejecución más cortos, pero no era compatible para su uso en el 3100. Antes de actualizar a los modelos 3130, pudimos obtener, en promedio, más de 900-950 bases Phred Q20 con nuestro protocolo de "lectura larga" y 850-900 bases Q20 con nuestro protocolo de "lectura estándar" utilizando nuestros protocolos modificados. El protocolo de "lectura larga" tiene un tiempo de ejecución de 2 horas y 45 minutos. Nuestro protocolo de "lectura estándar" se completa en 2 horas y 5 minutos. Parte de este trabajo se ha presentado en Biotechniques. (36 de junio de 2004 (6): 932-3). Con las actualizaciones de 3130, podemos obtener longitudes de lectura y puntajes de calidad similares en un período de tiempo algo más corto.

La electroforesis es facilitada por un circuito eléctrico de alto voltaje en el 3130. La carga es conducida a través del circuito por ADN e iones en el polímero, iones en el tampón usado en el instrumento y a través de cables eléctricos y electrodos. El 3130 puede disipar el calor de este voltaje de manera uniforme y eficiente debido a la gran superficie de los capilares de sílice fundida. Es este atributo el que permite aplicar alto voltaje durante la electroforesis y, como resultado, contribuye a reducir significativamente los tiempos de ejecución sin pérdida de resolución. Los secuenciadores más antiguos, como el Applied Biosystems 377, que empleaba un gel en placa para separar los fragmentos de ADN, tampoco podían disipar el calor y tenían que ejecutarse considerablemente más lento y durante más tiempo para alcanzar longitudes de lectura similares a las del 3130.

Los fragmentos de secuenciación pasan a través de una celda de detección al final de la matriz. Los fragmentos más cortos migran más rápidamente que los más largos y pasan a través de la celda de detección en este orden. Un rayo láser de iones de argón hace que los electrones de los tintes adheridos a los fragmentos de ADN se exciten a un estado de mayor energía. Cuando regresan a su estado fundamental, emiten fluorescencia. La fluorescencia emitida es capturada por una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). Esta cámara está compuesta por un chip de sílice con miles de píxeles que almacenan una carga eléctrica proporcional a la intensidad de la fluorescencia que le llega. La cámara CCD luego convierte la información de fluorescencia en datos electrónicos que se transfieren a una computadora para su procesamiento. El software procesa estos datos para crear un electroferograma donde cada pico representa un fragmento del producto de secuenciación de ADN.

¿Qué tipo de ADN podemos secuenciar y cuánto necesitamos?

El laboratorio de secuenciación de ADN puede secuenciar una variedad de muestras de ADN, incluidos plásmidos, cósmidos, productos de PCR, ADN de fago monocatenario y clones BAC o PAC. Al enviar ADN para secuenciación, y si proporciona sus propios cebadores de secuenciación, las concentraciones para los distintos tipos de ADN deben ajustarse de la siguiente manera:

Tipo de ADN Concentración requerida Total utilizado en una reacción
Plásmido 200-250 ng / ul 500-700 ng
Cósmido 200-250 ng / ul 500-700 ng
Producto de PCR 10-20 ng / ul 10 ng / 100 pb
Fago monocatenario 100-150 ng / ul 300 ng
BAC / PAC 300-400 ng / ul 700-900 ng
Su imprimación personalizada 1 uM = 1 pmol / uL =

* Por favor, ajuste sus concentraciones de cebador y de ADN en consecuencia para cumplir con nuestros requisitos de concentración.

A las concentraciones enumeradas anteriormente, usaremos aproximadamente 3-4 ul por reacción. Además, estas medidas no necesitan ser exactamente 200 ng / ul o 10 ng / ul o lo que sea aplicable; estas son aproximaciones de cuánto nos gustaría y si está un poco desviado, digamos, más o menos 30 ng / ul para plásmidos, 2-3 ng / ul para productos de PCR; probablemente aún estará bien, ya que hay un rango de concentraciones que podemos usar y aún así adquirir buenos datos de secuencia. Y si sus rendimientos son mucho más bajos que nuestros requisitos, tiene un par de opciones. Primero, si tiene acceso a una centrífuga de vacío, tome alícuotas de un volumen que contenga la cantidad TOTAL que usaríamos, séquelo y luego resuspenda en agua a la concentración que nos gustaría. Por ejemplo, si su concentración inicial de ADN plasmídico es solo 50 ng / ul, saque 10-15 ul, séquelo y luego agregue 3 ul de agua. Si no tiene acceso a una centrífuga de vacío, haga una nota en el campo de comentarios de su formulario de solicitud y utilizaremos un mayor volumen de su muestra en nuestra reacción de secuenciación del ciclo.

Sin embargo, tenga en cuenta que el volumen máximo de ADN que podemos agregar a una reacción de secuenciación es de 10 ul, por lo que para alcanzar nuestra cantidad mínima total de ADN, su concentración no puede ser mucho menos de 50 ng / ul para plásmidos o cósmidos, 70 -90 ng / ul para muestras de BAC y PAC. Si la concentración de su muestra es menor que eso y no tiene acceso a una centrífuga de vacío, avísenos y podemos secarla en nuestra centrífuga, o le mostraremos cómo hacerlo. Alternativamente, puede hacer una precipitación de etanol y resuspender en un volumen más pequeño para concentrar sus muestras, pero recuerde eliminar todos los rastros de etanol.

Generalmente, para los productos de PCR, el rendimiento del producto no es un problema si sus condiciones de PCR están optimizadas y son sólidas. Sin embargo, si tiene un producto de PCR grande que necesita secuenciarse, eso requerirá más ADN (por ejemplo, un producto de PCR de 2 kb requeriría 100-150 ng de ADN), por lo que es posible que desee ampliar su reacción o grupo múltiples reacciones juntas. Además, cuando proporcione sus propios cebadores personalizados, ajuste su concentración a 1 uM o 10 uM para muestras de BAC / PAC. A estas concentraciones, utilizaremos 4 ul de cebador por reacción. Proporcionamos algunos de los cebadores de vectores más comunes, de forma gratuita, para la secuenciación. Consulte el enlace en Primers que proporcionamos para ver la lista completa. Y siempre que sea posible, proporcione suficiente ADN y cebador para dos reacciones en caso de que necesitemos repetir una reacción por cualquier motivo.

Elegir su cepa huésped

La elección de la cepa huésped para la preparación de la plantilla es una consideración importante, ya que algunas cepas producirán ADN de calidad significativamente mejor para la secuenciación automatizada. Ciertas cepas de E. Coli pueden liberar ciertos factores, como endonucleasas y grandes cantidades de carbohidratos, durante su lisis, que pueden inhibir la preparación y secuenciación del ADN. Además, ciertos componentes celulares, como los polisacáridos cargados positivamente, pueden competir con el ADN por unirse en métodos de preparación de ADN a base de sílice que se utilizan comúnmente en muchos kits comerciales. Siempre se recomienda que consulte con los fabricantes de cepas específicas para determinar si existen dificultades conocidas que puedan surgir al usar sus cepas con sus aplicaciones. Las cepas hospedadoras que generalmente brindan datos confiables incluyen DH5alpha, DH10B, DH1, C600, XL1-Blue, XL10-Gold, TOP-10 y NM294. XL1 Blue crece más lentamente que la mayoría de las cepas y puede provocar una disminución del rendimiento de ADN, pero por lo general aún funciona bien. NO se recomiendan cepas como JM101, JM83, HB101, TB1 y TG1, ya que pueden liberar una gran cantidad de factores inhibidores durante la lisis que pueden conducir a un ADN de mala calidad que requerirá pasos de purificación adicionales.

Otros factores a considerar al prepararse para el crecimiento de cultivos son la elección del medio y la selección de antibióticos. Debe evitarse el crecimiento excesivo de células, ya que las células comienzan a lisarse con bastante rapidez después de alcanzar la fase estacionaria, liberando grandes cantidades de ADN plásmido y cromosómico degradado, así como polisacáridos que son difíciles de separar del ADN plásmido. Por lo general, se recomiendan medios LB estándar o medios Richer tamponados, ya que un cultivo durante la noche de 10 a 12 horas generalmente dará una densidad celular adecuada para cargar en columnas o membranas y, además, tendrá una proporción mucho menor de materiales celulares degradados y ADN contaminante. . Es mejor evitar medios como TB o 2xYT, ya que alcanzarán la fase estacionaria mucho antes y, por lo tanto, un cultivo durante la noche dará una densidad celular inapropiadamente alta, así como un mayor porcentaje de sustancias inhibidoras. Si tuviera que utilizar medios como estos, es aconsejable controlar el tiempo de cultivo y el número de células para evitar la contaminación del ADN y la sobrecarga de la columna. Un truco que puede probar es lavar las células sedimentadas con NaCl 0,5 M justo antes de la lisis para ayudar a eliminar los polisacáridos y los materiales de los medios que pueden eluirse conjuntamente con su ADN. Resuspenda el sedimento en la solución de NaCl 0,5, agite bien y gire de nuevo, eliminando el sobrenadante cuando haya terminado.

La selección de antibióticos debe mantenerse en todo momento para evitar el crecimiento de células que no contienen plásmido. En ausencia de una selección eficaz, las células que no contienen plásmido crecerán más que las células que sí lo hacen, lo que conducirá a un escaso rendimiento del ADN deseado. Además, algunos plásmidos metabolizarán ciertos antibióticos, como la ampicilina, durante el crecimiento celular, por lo que es importante proporcionar concentraciones adecuadas de antibióticos para minimizar el agotamiento. Los antibióticos deben tomarse en alícuotas y congelarse para mantener una eficacia óptima.

Preparación y purificación de plantillas

La pureza y concentración de la plantilla son los dos factores más importantes para obtener datos de secuencia de buena calidad. La pureza y concentración de la plantilla son los dos factores más importantes para obtener datos de secuencia de buena calidad. No, esto no es un error tipográfico, es solo que no podemos enfatizar lo suficiente este principio cuando se trata de secuenciación fluorescente automatizada, especialmente en nuestras 3130, que requieren métodos de limpieza aún más estrictos. La secuenciación fluorescente es muy sensible a ciertos contaminantes en la muestra de ADN y el ADN que se considera lo suficientemente limpio para muchos otros procedimientos de biología molecular como la PCR, la clonación o incluso la secuenciación radioactiva manual, NO es necesariamente lo suficientemente limpia para la secuenciación fluorescente y puede conducir a una mala datos de calidad o, a veces, ningún dato. En esta sección, enumeramos nuestras recomendaciones sobre las mejores formas de limpiar y cuantificar su ADN, según el tipo de ADN que esté intentando secuenciar.

Los kits de Qiagen son uno de los métodos más universalmente aceptados para proporcionar ADN de alta calidad constante para la secuenciación automatizada. Esto no quiere decir que no haya otros métodos que no funcionen (hemos enumerado algunos otros protocolos recomendados), pero según nuestra experiencia, los métodos de limpieza de Qiagen tienen el mejor historial de confiabilidad y consistencia en su producto final.

Otra opción disponible para la purificación de ADN que proporciona una plantilla de alta calidad para la secuenciación automática de ADN es el kit de aislamiento de ADN miniplásmido disponible en el Centro de servicios de investigación biomédica (BRSC) en SUNY Buffalo. Este kit es "un método de minipreparación de lisis alcalina modificado y optimizado de Sambrook et al. (Molecular Cloning, CSH, NY) que elimina la necesidad de un tratamiento adicional con RNasa y extracción con fenol-cloroformo. El ADN plasmídico se puede purificar fácil y rápidamente a partir de un cultivo de E. coli durante la noche en 15 minutos con un rendimiento típico de 1 a 5 mg de ADN por ml de cultivo. El ADN es adecuado para la digestión de restricción, la preparación de sondas y el análisis de PCR. El ADN que se utilizará para el análisis de secuenciación se somete a una paso adicional de 5 minutos de precipitación con PEG (PS-4) para eliminar cualquier traza de ARN. Se pueden obtener fácilmente lecturas de secuenciación de ADN de alta calidad (casi 1000 bases resueltas por serie de secuenciación) si el ADN plasmídico se aísla de un E adecuado cepa huésped. coli. El kit (suficiente para 300 minipreparaciones) es estable durante al menos un año si se manipula y almacena correctamente ". (tomado del sitio web de BRSC). A $ 95 por 300 minipreparaciones de plásmido, este kit es significativamente más barato que los kits de Qiagen (aproximadamente una cuarta parte del costo), rápido y muy simple de usar. Hemos visto, de primera mano, que la calidad del ADN obtenido de este kit es excelente para la secuenciación y recomendamos el uso de este kit para la purificación del ADN. El BSRC es un recurso local de SUNY que promueve la investigación traslacional colaborativa, desarrolla y comercializa productos innovadores y fabrica reactivos de investigación de calidad para la amplia comunidad de ciencias de la vida. Para obtener más información sobre el BSRC y sus productos, puede consultar su sitio web en: http://www.acsu.buffalo.edu/

Puede encontrar un enlace al protocolo del kit de aislamiento de ADN de mini plásmido en: Protocolo de preparación de mini plásmido.

Plantillas de plásmidos

Consideraciones al limpiar las preparaciones de plásmidos

La mala calidad de la plantilla es una de las razones más comunes de los datos de secuencia incorrectos, como se mencionó anteriormente, y es una consideración primordial al elegir un método de limpieza de plásmidos para proporcionar ADN de pureza óptima para la secuenciación automatizada. La calidad de la plantilla de plásmido puede verse afectada por una variedad de factores y contaminantes, incluidos los siguientes:

  • Sales u orgánicos sobrantes de la preparación de la plantilla
  • Presencia de componentes celulares como ARN, proteínas, polisacáridos o ADN cromosómico
  • ADN que se ha degradado durante el almacenamiento
  • Finas de sílice que se trasladan de los kits de preparación de plantillas que utilizan resinas sueltas o soluciones de sílice

Aquí hay una tabla de contaminantes permitidos y sus rangos de concentración aceptables que aún permitirán buenos datos de secuenciación:

Contaminante Cantidad tolerada en la reacción de secuenciación
ARN 1 ug
CLAVIJA 0.3%
NaOAc 5-10 mM
Etanol 1.25%
Fenol 0%
CsCl 5 mM
EDTA 0,25 mM

A continuación se enumeran algunos comentarios sobre los efectos de algunos de estos contaminantes:

ARN - Como puede ver en el valor de la tabla anterior, en realidad se puede tolerar una cantidad significativa de ARN en la reacción de secuenciación. Es un contaminante común en las minipreparaciones de plásmidos, especialmente cuando las columnas están sobrecargadas y se excede la capacidad de los tampones de lisis; la sobrecarga puede ser un problema con las minipreparaciones de Qiagen. Una de las formas en que el ARN puede interferir potencialmente es cuando se cuantifican las preparaciones de ADN con un espectrofotómetro: el ARN también absorbe a 260ºC y cuando hay una gran cantidad presente, realmente puede alterar la precisión de su concentración. Es mejor, entonces, tratar sus preparaciones de plantilla con RNasa o precipitación alta en sal y también cuantificar sus muestras tanto por gel como espectroscópicamente.

CLAVIJA- la presencia de polietilenglicol residual en la preparación de la plantilla puede tener un efecto inhibidor sobre el ciclo de secuenciación de la enzima polimerasa Taq y producir una señal débil.

Sales- la procesividad de la polimerasa Taq utilizada en la reacción de secuenciación del ciclo disminuye en presencia de grandes cantidades de sales. La contaminación por sal en las preparaciones de ADN puede resultar de la coprecipitación de sales en las precipitaciones de alcohol, la eliminación insuficiente del sobrenadante después de las precipitaciones o un lavado incompleto del sedimento con etanol al 70%. Se debe utilizar una técnica cuidadosa al precipitar con alcohol.También se ha demostrado que los iones acetato, a diferencia de los iones sodio, potasio o cloruro, son los más inhibidores en las reacciones de secuenciación. Cuando se usa acetato de potasio o acetato de sodio, concentraciones superiores a 20 mM conducen al fracaso completo de las reacciones de secuenciación, mientras que se requieren concentraciones de cloruro de sodio de 60 mM antes de la inhibición completa. Las sales pueden ser inhibidoras cuando secuenciamos muestras en nuestro 377 basado en gel, pero son aún más problemáticas cuando se procesan muestras en nuestro sistema capilar 3100, ya que estas sales cargadas más pequeñas se inyectan preferentemente e interfieren con la migración de las muestras de ADN.

Etanol- La contaminación por etanol puede ocurrir cuando la muestra no se seca lo suficiente después de la precipitación o cuando se transfiere a un tampón de lavado que contiene etanol utilizado en algunos procedimientos de aislamiento de ADN. La contaminación con concentraciones de etanol al 10% o más generalmente conduce al fracaso de la reacción de secuenciación del ADN. Se requiere un secado completo de las muestras de ADN para eliminar estas trazas de etanol.

Fenol- El fenol puede ser transferido de los métodos de lisis alcalina de ADN que utilizan fenol y cloroformo para eliminar proteínas y otros contaminantes celulares de los lisados ​​celulares. El fenol no se puede tolerar en la reacción de secuenciación del ciclo, ya que desnaturaliza las proteínas y, por lo tanto, degrada la enzima polimerasa Taq utilizada en la reacción de secuenciación del ciclo. El cloroformo no tiene las fuertes propiedades desnaturalizantes del fenol y no parece afectar negativamente la reacción de secuenciación.

Cloruro de cesio - Cuando se utiliza un protocolo de gradiente de densidad de ultracentrifugación de cloruro de cesio, se puede obtener ADN de muy alta calidad adecuado para secuenciación automatizada. SIN EMBARGO, se recomienda encarecidamente que realice diálisis seguida de precipitación con etanol (el mejor método) o una precipitación mínima de isopropanol a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de cloruro de cesio residual, ya que el cesio puede inhibir la polimerasa Taq utilizada en la reacción de secuenciación del ciclo.

EDTA - El EDTA puede quelar el magnesio requerido por la polimerasa Taq en la reacción de secuenciación del ciclo, por lo que al enviar muestras, es mejor tenerlas siempre diluidas o resuspendidas en tampón estéril ddH20 o 1X Tris. No se recomienda la suspensión en el búfer TE, aunque la gente lo ha hecho y muchas veces no hay problema. Sin embargo, proporcionar ADN de plantilla en agua es algo fácil de hacer y si hay un problema con la calidad de su secuencia, el hecho de que no haya EDTA en su muestra es un problema potencial que podemos eliminar de inmediato.

Principios del kit de Qiagen

Como se mencionó anteriormente, Qiagen fabrica kits para extraer y purificar todo tipo de ADN, incluido el ADN plasmídico. Los kits de minipreparación de plásmidos de Qiagen contienen una resina de intercambio aniónico que consta de grupos DEAE cargados positivamente que se unen preferentemente a la cadena principal de ADN cargada negativamente. Una vez que el ADN se une a la resina, otros contaminantes como sales, proteínas, ARN y carbohidratos se eliminan en un tampón bajo en sal. El ADN se eluye en un segundo paso, utilizando un tampón con alto contenido de sal para disociarlo de la resina. Este kit está diseñado para proporcionar ADN de la más alta pureza y es algo más costoso. Otro kit ofrecido por Qiagen es el kit Qiaprep que utiliza una membrana a base de gel de sílice para unir el ADN en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas. Las sales se eliminan con un lavado con etanol y luego el ADN se eluye con un tampón Tris de baja fuerza iónica. Este método viene en un formato de columna de centrifugado que se puede utilizar en una centrífuga o en un colector de vacío. Este kit proporciona ADN de una pureza que es adecuada para la secuenciación y también es menos costoso. Sin embargo, hay algunos factores que se deben tener en cuenta al utilizar los kits de Qiagen o cualquier otro kit de minipreparación basado en columnas. Primero, no sobrecargue las columnas: el ARN y los polisacáridos pueden competir con el ADN por unirse a la resina de la columna y dar lugar a bajos rendimientos del ADN plasmídico deseado. Siga las instrucciones para el crecimiento celular y use los medios LB como se recomienda. En segundo lugar, no olvide lavar el ADN con etanol al 70% después de la precipitación con isopropanol para eliminar el exceso de sales. Lavar de dos a cuatro veces con etanol puede mejorar la calidad del ADN y, además, lavados adicionales con la solución aglutinante pueden ayudar a eliminar otros contaminantes. En tercer lugar, calentar el tampón de elución puede ayudar a mejorar el rendimiento. Y por último, elimine todo rastro de etanol antes de resuspender el producto final en agua.

Métodos de lisis alcalina / PEG

Las bacterias se pueden lisar para liberar ADN plasmídico mediante varios métodos, incluido el tratamiento con detergentes, disolventes orgánicos, calor o álcali. Al intentar aislar plásmidos grandes (& gt15kb) que son más susceptibles a dañarse durante el procedimiento de lisis, se debe utilizar un método más suave, como la centrifugación en equilibrio o la lisis con un detergente como SDS. Cuando se lisan células para recolectar plásmidos más pequeños, se pueden utilizar métodos más fuertes, como el tratamiento con álcalis. Estos tratamientos hacen que el ADN cromosómico lineal del huésped se desnaturalice y se degrade. Las hebras circulares cerradas de ADN plasmídico no se separan por completo, ya que están entrelazadas topológicamente y cuando las condiciones vuelven a la normalidad, las hebras se vuelven a recocer precisamente en la conformación nativa como moléculas superhelical.

Los protocolos de lisis alcalina estándar, cuando se combinan con la precipitación con PEG, pueden conducir a un ADN plasmídico pequeño de suficiente pureza para su uso en secuenciación fluorescente automatizada. El siguiente es un protocolo detallado para el tratamiento de lisis alcalina / PEG recomendado por Applied Biosystems, fabricantes de nuestros secuenciadores de ADN.

Nota: Para minimizar el corte del ADN cromosómico contaminante, no utilice un vórtice durante este procedimiento.

  1. Pellet de 1,5 a 4,5 ml de alícuotas de cultivo durante 1 minuto en una microcentrífuga a máxima velocidad.
  2. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
  3. Resuspenda el sedimento bacteriano en 200 ul de tampón GET pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  4. Añada 300 ul de NaOH 0,2 N / SDS al 1% recién preparado. Mezclar el contenido del tubo por inversión. Incubar en hielo durante 5 minutos.
  5. Neutralizar la solución añadiendo 300 ul de acetato de potasio 3,0 M, pH 4,8. Mezclar invirtiendo el tubo. Incubar en hielo durante 5 minutos.
  6. Retire los restos celulares girando en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio.
  7. Agregue RNasa A (sin ADNasa) hasta una concentración final de 20 ug / ml. Incubar el tubo a 37 ° C durante 20 minutos.
  8. Extraiga el sobrenadante dos veces con cloroformo:
    1. agregar 400 ul de cloroformo
    2. mezclar las capas por inversión durante 30 segundos
    3. centrifugar el tubo durante 1 minuto para separar las fases
    4. transfiera la fase acuosa superior a un tubo limpio.

    Purificación de cloruro de cesio

    La purificación de ADN plasmídico mediante un método de gradiente de densidad, como la centrifugación en equilibrio en gradientes de CsCl-bromuro de etidio, puede producir ADN ultrapuro y es especialmente útil para purificar plásmidos grandes o pequeños que se utilizarán en experimentos más rigurosos, como mediciones biofísicas. Este protocolo aprovecha el hecho de que el bromuro de etidio se intercala en diferentes cantidades cuando se encuentra con moléculas de ADN circulares lineales o cerradas. Debido a la unión diferencial de este tinte, las densidades flotantes de ADN circular lineal y cerrado que se forman después de la centrifugación serán diferentes en gradientes de CsCl que contienen cantidades saturantes de bromuro de etidio, lo que permite una separación efectiva del ADN plasmídico del ADN cromosómico contaminante, cortado ADN plásmido circular, ARN y proteínas. Este método ha sido durante mucho tiempo el estándar de oro para obtener ADN muy puro, pero requiere bastante tiempo y es caro. Los kits comerciales o los métodos de lisis alcalina modificada proporcionan ADN de calidad adecuada para la secuenciación automatizada y, por lo tanto, eliminan la necesidad de un método tan estricto. Sin embargo, si la purificación con cloruro de cesio es su método de elección, los protocolos se pueden encontrar en los manuales de clonación molecular de Maniatis.

    Algunas notas finales sobre las purificaciones de plásmidos

    Los métodos de ebullición de extracción de ADN no son aceptables para la secuenciación automática a menos que se extraigan con fenol / cloroformo para eliminar todas las proteínas. Las endonucleasas no siempre se inactivan completamente durante el procedimiento de ebullición y el ADN plasmídico se puede degradar en presencia de Mg ++ en los procedimientos de incubación posteriores.

    Y si, al final, su preparación de plásmidos aún no tiene la pureza óptima para obtener buenos datos de secuencia de nuestros secuenciadores, aquí hay algunas recomendaciones para pasos de limpieza adicionales que pueden ayudar:

    • Purifique su ADN mediante ultrafiltración, utilizando las columnas de microconcentrador Centricon-100. Consulte el protocolo en Columnas de corte de ultrafiltración / peso molecular.
    • Purificar mediante extracción adicional:
      1. Extraer el ADN dos veces con 1 volumen de cloroformo o cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1 v / v)
      2. Agregue 0,16 volúmenes de NaCl 5 M y 1 volumen total de PEG al 13%.
      3. Incubar en hielo durante 20 minutos, luego centrifugar a velocidad máxima en una microcentrífuga a 2-6C durante 20 minutos.
      4. Enjuague el sedimento dos veces con etanol al 70%.
      5. Seque el sedimento en una centrífuga de vacío durante 3-5 minutos o hasta que se seque.
    • Purificar usando precipitaciones mínimas de isopropanol:
      1. Añada 0,5 volúmenes de acetato de amonio 7,5 M o 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M a una solución de ADN diluida (& lt100 ng / ul) y mezcle bien.
      2. A este volumen total, agregue 0.6 volúmenes de isopropanol a temperatura ambiente y mezcle bien.
      3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego centrifugar a máxima velocidad para sedimentar el ADN.
      4. Llene el tubo con etanol al 70% y haga un lavado completo del sedimento.
      5. Seque el sedimento en una centrífuga de vacío durante 3-5 minutos o hasta que se seque.

    Productos de PCR

    Consideraciones al limpiar productos de PCR

    Al enviar productos de PCR para secuenciación directa, es esencial separar el producto de PCR de las sustancias potencialmente interferentes que pueden permanecer en solución después de la reacción de PCR. A veces, estos contaminantes pueden participar y, por lo tanto, interferir en la reacción de secuenciación del ciclo y dar lugar a datos de mala calidad o ningún dato en absoluto. Lo más importante es eliminar los cebadores y dNTPS. Si los cebadores de PCR directos e inversos permanecen en solución, ambos actuarán como cebadores de secuenciación, lo que dará como resultado múltiples picos de principio a fin, ya que cada cebador puede aparearse con hebras complementarias con diferente composición de nucleótidos y, por lo tanto, conducir a fragmentos superpuestos y datos ilegibles. El exceso de dNTP también debe eliminarse, ya que alterarán las proporciones específicas de dNTP / ddNTP requeridas para una extensión y terminación óptimas en la reacción de secuenciación del ciclo.

    Otra consideración al elegir su método de limpieza de PCR es la determinación de la presencia de una o varias bandas que pueden resultar de su reacción de PCR. Una vez que se completa la reacción de PCR, debe ejecutar una pequeña alícuota en un gel de agarosa para evaluar su calidad. Si tiene una sola banda específica, será suficiente eliminar el exceso de reactivos de PCR utilizando uno de los métodos que se enumeran a continuación. Si su reacción de PCR genera múltiples bandas, una cantidad excesiva de dímeros de cebadores o manchas de baja intensidad, entonces será necesario ejecutar su producto de PCR en un gel, extirpar su banda de interés y purificarla del gel. . Alternativamente, es posible que desee dedicar algún tiempo a optimizar su reacción de PCR para eliminar la presencia de estas bandas o artefactos adicionales y, por lo tanto, ahorrarse algo de tiempo en la purificación en gel de sus productos de PCR para la secuenciación.

    Independientemente del método de purificación que elija, siempre debe cuantificar su producto de PCR después de la purificación, ya que ningún método de limpieza proporcionará una recuperación del 100%. Cualquier estimación cuantitativa que haga al ejecutar inicialmente su producto de PCR en un gel analítico será inexacta, ya que inevitablemente perderá algo de producto durante la purificación, especialmente cuando se purifica en gel.

    Banda de PCR única

    Kit de purificación de PCR Qiaquick

    Qiagen fabrica kits de purificación de PCR que vienen en formato de microcentrífuga o colector de vacío, y pueden procesar desde un producto de PCR utilizando columnas de centrifugación hasta 96 muestras en una placa de 96 pocillos. Los fragmentos que varían en tamaño desde 100 pb hasta 10 kb pueden purificarse de cebadores, dNTP y sales que pueden interferir en la reacción de secuenciación. El protocolo es simple e implica la unión del ADN a la columna o la membrana del pozo, el lavado de los contaminantes y la elución del ADN de la membrana. Una cosa buena de este kit es que no hay pasos adicionales para eliminar cualquier aceite mineral que pueda estar presente en la solución de PCR.

    Exonucleasa I / Fosfatasa alcalina de camarón

    ExoSAP-IT es un producto fabricado por USB Corporation y es un método excelente para purificar reacciones de PCR que producen una banda específica. El componente Exonucleasa I funciona para hidrolizar cualquier cebador monocatenario residual y cualquier fragmento de ADN monocatenario producido en la reacción de PCR. La fosfatasa alcalina de camarón degrada cualquier exceso de dNTPS que quede en la reacción. La mezcla ExoSAP se agrega directamente a la reacción de PCR, se incuba a 37ºC durante 15 minutos para la hidrólisis de ADN monocatenario y dNTPS, y luego se incuba a 80ºC durante 15 minutos para inactivar las enzimas.

    Columnas de ultrafiltración / corte de peso molecular

    Los dispositivos Amicon Microcon y Centricon, que pueden adquirirse en Millipore, están disponibles con membranas de corte de peso molecular [MWCO] de 30.000 y 100.000 y pueden separar los cebadores del producto de PCR sintetizado. Al purificar productos de PCR más pequeños (170 pb o menos), elija el Centricon 30. Para productos de PCR más grandes, el Centricon 100 funciona bien. Concentrarán y desalinizarán el ADN simultáneamente, por lo general eliminando más del 90% de los cebadores y dNTP no incorporados. Cuando se usa cualquiera de los dispositivos, se coloca una pequeña taza de muestra, o depósito, en un tubo de recolección. El depósito contiene la membrana de exclusión de tamaño en su superficie inferior. El producto de PCR se carga en el depósito de muestra junto con un volumen adecuado de agua destilada (400 ul cuando se usa el filtro Microcon, 2 ml para el Centricon) y luego se centrifuga en una centrífuga. Las sales, los dNTP y los cebadores se introducen en el tubo de recogida. Para recuperar el ADN purificado, retire el depósito de muestra del vial, inviértalo en un tubo nuevo y vuelva a girar. El producto de PCR limpio se capturará en el segundo vial de recolección. Debido al mayor volumen de lavado y factor de concentración, un giro en un dispositivo Centricon elimina & gt95% de una imprimación de 25 pb. Un segundo giro elimina hasta un 4% adicional. El filtro Microcon se beneficiará de lavados adicionales: un lavado elimina aproximadamente el 87% de los cebadores, mientras que tres lavados filtrarán entre el 95% y el 99% de los cebadores de tamaño PCR estándar.

    Precipitación de etanol

    Si se realiza con cuidado, la precipitación con etanol producirá productos de PCR de pureza adecuada para la secuenciación directa. Sin embargo, si no se hace correctamente, los cebadores residuales y dNTPS, así como el etanol restante, darán datos de secuencia deficientes, así que asegúrese de eliminar el sobrenadante con cuidado y por completo, y vigile el sedimento.

    Ambos protocolos enumerados a continuación son para reacciones de PCR de 50 ul, que tienden a dar mejores rendimientos después de la purificación, especialmente para productos más grandes. Para reacciones de PCR superiores a 50 ul, aumente proporcionalmente los reactivos enumerados. Para reacciones de menos de 50 ul, agregue agua para llevar el volumen a 50 ul. Si hay aceite mineral en la reacción de PCR, agregue 100 ul de cloroformo (no mezcle con la solución de PCR), centrifugue a 10,000 RPM durante 30 segundos y luego aspire el sobrenadante en un tubo limpio. El componente de cloroformo / aceite mineral se depositará en el fondo.

    • Protocolo 1
      Mezcle bien 25 ul de acetato de amonio 7,5 M con 190 ul de etanol al 95%. Agregue sobrenadante purificado (si se usó anteriormente aceite mineral) o su solución de PCR a esta mezcla. Agite en el vórtex y colóquelo en hielo, o a -20ºC, durante 30 minutos para precipitar los productos de la PCR. Centrifugar a 10.000 RPM durante 10 minutos a 4ºC. Retire completamente el sobrenadante y seque el sedimento, ya sea secando al aire o en una centrífuga de vacío (no secar en exceso, unos minutos en una centrífuga de vacío estará bien). Resuspender en 20 ul de agua.
    • Protocolo 2
      Mezcle bien 5 uL de acetato de sodio 3 M, pH 4.6, con 100 uL de etanol al 95%. Agregue sobrenadante purificado o su solución de PCR a esta mezcla. Agite en el vórtex y colóquelo en hielo, oa -20ºC, durante 30 minutos para precipitar los productos de PCR. Girar los tubos en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 20 minutos. Retire completamente el sobrenadante y deséchelo. Agregue 300 ul de etanol al 70% para enjuagar el sedimento, agite brevemente y centrifugue durante 5 minutos adicionales a velocidad máxima. Retire completamente el sobrenadante y deséchelo, teniendo cuidado de no perder el sedimento. Secar el sedimento y resuspender en 50 ul de agua.

    Varias bandas de PCR

    Purificación de gel

    Cuando se purifica un producto de PCR mediante filtración en gel, se puede utilizar agarosa estándar o de bajo punto de fusión con tampón TBE o TAE. Sin embargo, es importante utilizar agarosa de alta calidad como FMC SeaPlaque o SeaPrep para minimizar el arrastre de contaminantes no deseados que pueden inhibir la reacción de secuenciación. Al purificar la banda de PCR, el gel que contiene el producto de PCR de interés se visualiza primero bajo una fuente de luz ultravioleta y luego la banda se extrae del gel de agarosa con una navaja limpia y afilada; minimice la cantidad de agarosa que se corta con la banda, incluso si eso significa perder un poco de ADN. Pequeños trozos de agarosa pueden tener un efecto adverso en la reacción de secuenciación. Además, es importante recordar que la luz ultravioleta daña su ADN; el daño puede ocurrir en el tiempo que le toma cortar su banda y su efecto puede hacerse evidente al secuenciar su ADN, ya que puede ver longitudes de lectura dramáticamente acortadas. Por lo tanto, siempre que sea posible, reduzca la intensidad de la fuente de luz ultravioleta, reduzca los tiempos de exposición o utilice una fuente de luz ultravioleta de 366 nm si está disponible. Colocar una placa de vidrio entre la fuente de luz y su gel también puede ayudar a disminuir el efecto degradante de la luz ultravioleta en su ADN. Una vez que la banda de interés se ha aislado del gel, se pueden utilizar numerosos métodos para separar el producto de PCR de la rodaja de agarosa, incluido el kit de purificación en gel Qiaquick (MÁS recomendado), el kit Millipore Ultrafree con tampón TAE modificado, Promega PCR Wizard preparaciones y kits Bio101 Geneclean. Siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante.

    Los productos de PCR también deben examinarse y cuantificarse en un gel de agarosa DESPUÉS de la purificación del gel, ya que no obtendrá una recuperación del 100% y su concentración de PCR supuesta para la secuenciación no será precisa.

    ADN de BAC / PAC

    Consideraciones al limpiar el ADN de BAC / PAC

    Al intentar secuenciar grandes plantillas de ADN, como cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o cromosomas artificiales derivados de P1 (PAC), la calidad de la plantilla de ADN se vuelve aún más crucial. Al igual que con la purificación del ADN plasmídico, los kits de Qiagen dan excelentes resultados para la purificación del ADN de BAC para la secuenciación y proporcionan algunos métodos diferentes para limpiar el ADN de la plantilla, incluidos los cartuchos Qiafilter y un kit Large-Construct, este último algo más complicado. Wenjie Wu nos ha proporcionado amablemente un protocolo modificado del kit Qiafilter Plasmid Midi, que siempre ha proporcionado ADN de BAC de buena calidad para la secuenciación, y publicaremos sus modificaciones aquí.

    • utilizar 100 ml de cultivo BAC
    • Tampón P1: añadir 10 ml
    • Tampón P2: añadir 10 ml
    • Tampón P3: añadir 10 ml
    • después de la adición de tampón P3, incubar la muestra en hielo durante 15 min, luego centrifugar a 4000 rpm durante 30 minutos a 4ºC (sin incubación a temperatura ambiente).
    • agregue el sobrenadante de la muestra centrifugada al cartucho y filtre las muestras en un tubo limpio
    • aplique el sobrenadante filtrado a la punta de Qiagen para una mayor purificación y siga el protocolo de Qiagen restante.
    • al eluir el ADN, calentar primero la solución de QF a 65ºC y eluir 5 x 1 ml para maximizar el rendimiento.

    Se pueden usar otros métodos de purificación de BAC, incluida la purificación de CsCl, y algunos otros protocolos están disponibles en los siguientes sitios web:

    Centro avanzado de tecnología del genoma de la Universidad de Oklahoma:
    http://www.genome.ou.edu/DblAcetateProcV3.html

    Nota: el ADN de BAC preparado en el instrumento Autogen generalmente no funciona bien para la secuenciación

    Métodos de cuantificación

    Hay tres métodos que se utilizan comúnmente para cuantificar el ADN: espectrofotometría, análisis en gel de agarosa y fluorometría. Estos métodos también pueden darle una idea de cuán limpio está su ADN, aunque ninguno de estos métodos detectará todo. Cuando utilice el espectrofotómetro, normalmente tomará lecturas tanto en A260 como en A280, ya que el ADN se absorberá en A260 mientras que la proteína se absorberá en A280. Estas lecturas le darán una relación A260 / A280. Una buena proporción de ADN A260 / A280 debe estar entre 1,7 y 1,9. Si encuentra que su proporción es menor, esto podría indicar contaminación de su muestra con proteínas o químicos orgánicos. Si es posible, use un espectrofotómetro que sea capaz de realizar un barrido de longitud de onda de 220 nm a 330 nm, ya que un barrido puede ser útil para revelar otros contaminantes como el fenol, que es detectable a 230 nm, y partículas en solución que pueden absorber a 325 nm. Al calcular su concentración de ADN con un espectrofotómetro, necesitará saber que un A260 O.D. unidad (absorbancia) de ADN bicatenario contiene 50 ng / ul. Un O.D. unidad es la cantidad de una sustancia disuelta en 1 ml que da una lectura de absorbancia de 1.0 en un espectrofotómetro con una longitud de trayectoria de 1 cm. Entonces, para calcular la concentración de ADN que tiene, multiplicará el valor de absorbancia por el factor de conversión de 50 ng / ul por cualquier factor de dilución que haya utilizado y esto le dará la concentración de su muestra en ng / ul o mg / ml. Sin embargo, la cuantificación de su ADN por especificación es probablemente el menos preciso de los tres métodos, ya que tanto el ARN como el ADN contaminante también absorberán a 260 nm y pueden conducir potencialmente a valores inexactos. Además, las lecturas superiores a 1,0 DO o inferiores a 0,05 probablemente no sean muy precisas, lo que limita la sensibilidad y el rango de este método.

    La cuantificación mediante electroforesis en gel de agarosa tiende a ser más precisa, ya que puede visualizar cualquier ADN o ARN contaminante. El ADN purificado debe correr como una sola banda en un gel de agarosa, mientras que el ADN plasmídico sin cortar mostrará tres bandas: superenrollado, mellado y lineal. Este método también es útil cuando se cuantifican pequeñas cantidades de ADN, como productos de PCR. La muestra de ADN se procesa en un gel junto a una escalera de masa compuesta de fragmentos de concentraciones conocidas y variables y la intensidad de su banda de ADN se compara visualmente con las intensidades de las bandas de la escalera de masa para estimar la concentración de ADN. Cuando se usa un gel de agarosa, no se puede detectar la presencia de proteínas o sustancias químicas. Para obtener la mayor cantidad de información sobre la cantidad y la calidad de su ADN deseado, se deben usar juntos los métodos de cuantificación espectroscópica y de gel.

    Quizás el método de medición más preciso de los tres es el uso de un fluorómetro. Pueden añadirse colorantes al ADN, como Hoechst 33258 Dye o Picogreen, que se intercalan en regiones ricas en AT de ADN bicatenario y, por tanto, son bastante específicos del ADN bicatenario, evitando los problemas de contaminación del ARN que se observan cuando se utiliza un espectrofotómetro. Los contaminantes comunes presentes en las preparaciones de ADN como sales, urea, etanol, cloroformo, detergentes, proteínas y agarosa no tienen un efecto significativo en estos ensayos y, por lo tanto, conducen a un método de cuantificación mucho más sensible y preciso. Las mediciones fluorométricas pueden detectar niveles de ADN tan bajos como 5 ng / ul.

    Diseño de imprimación

    Hay muchos programas en Internet que pueden ayudarlo a elegir cebadores, determinar la posible formación de dímeros de cebadores o estructuras en horquilla y calcular la Tm. Estos programas pueden resultar especialmente útiles cuando necesita diseñar varios conjuntos de cebadores para garantizar la cobertura de una gran región de ADN. Consulte nuestra sección Enlaces útiles para ver algunos programas de diseño de imprimaciones que nos han resultado útiles. Dicho esto, aquí hay algunas reglas comunes para secuenciar el diseño de cebadores:

    • El cebador debe tener una longitud de 18-24 nucleótidos, lo que ayuda a garantizar una hibridación buena y específica con el ADN molde. Los cebadores largos (& gt35-40bp) tienden a no funcionar tan bien en la secuenciación debido a las mayores posibilidades de formación de estructuras secundarias
    • El contenido de G / C debe ser aproximadamente del 50%, pero el rango puede ser del 30 al 80%.
    • La Tm debe estar entre 50º-60ºC - si su Tm está muy por debajo de eso, puede que no hibride correctamente, ya que la temperatura de recocido en nuestra reacción de secuenciación de ciclo es 50ºC. Si es necesario, agregue algunas bases más a su imprimación para aumentar su Tm. Para calcular la Tm de su imprimación, utilice la siguiente fórmula:
      • Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) º C

      Como última nota sobre el pedido de cebadores, si bien la pureza de un cebador es importante, generalmente no es necesario tener cebadores ultrapuros, como los purificados por HPLC o cartucho OPC, aunque eso es, por supuesto, óptimo. Siempre que la eficacia de la síntesis de oligonucleótidos sea alta y la mayoría de su solución de imprimación contenga imprimaciones completas, entonces la simple desalación de sus imprimaciones debería estar bien. Los cebadores de baja calidad de síntesis no funcionarán bien para la secuenciación porque, junto con su producto de longitud completa, habrá una mayor proporción de cebadores "fallidos" (es decir, cebadores truncados de menos de la longitud completa, en diferentes tamaños) que también pueden actuar como cebadores de secuenciación. Los datos de secuencia de estos cebadores serán deficientes, desde picos inutilizables hasta picos de "sombra" menores debajo de los picos adecuados. Vea más en nuestra sección Solución de problemas para ver cómo reconocer este problema. Cuando envíe cebadores personalizados para secuenciar, dilúyalos en agua hasta la concentración adecuada.

      Para los aficionados al bricolaje

      Para aquellos que eligen la opción económica de configurar sus propias reacciones de secuenciación, se deben tener en cuenta ciertas cosas. Primero, necesitará comprar el kit para realizar sus reacciones de secuenciación de ciclos. La secuenciación cíclica es el método necesario para amplificar y etiquetar con fluorescencia su ADN para que pueda detectarse en nuestros secuenciadores automáticos. La secuenciación de ciclos es muy similar a la PCR, pero con dos diferencias principales. En la secuenciación cíclica, se utiliza un cebador en lugar de dos, lo que proporciona una amplificación lineal de una hebra marcada. Además, se usa una mezcla de dNTP marcados y no marcados en la mezcla de reacción para permitir el marcaje fluorescente del ADN y la terminación de la cadena del fragmento. Lea nuestra sección Principios de secuenciación automática de ADN fluorescente para obtener información más detallada sobre los conceptos básicos de la secuenciación de ciclos. Una vez que se hayan configurado las reacciones, deberá ejecutarlas en un termociclador para efectuar la incorporación de ddNTP marcados con fluorescencia y la amplificación del ADN deseado. Una vez que se completa la reacción de secuenciación del ciclo, deberá purificar la reacción para eliminar las sales, los reactivos no utilizados y, lo más importante, las moléculas Dye Terminator no incorporadas. Si este paso no se realiza con cuidado, estas moléculas de colorante en exceso migrarán junto con su ADN y causarán lo que se conoce como "manchas de colorante" que pueden interferir con la llamada base adecuada de su ADN. Consulte la sección Solución de problemas para ver un ejemplo de una gota de tinte.

      Dicho esto, a continuación proporcionamos nuestras recomendaciones y protocolos, así como una lista de algunos suministros y números de pieza que necesitará para comenzar.

      Reactivos

      Las mezclas de reacción de secuenciación de ciclo deben adquirirse en Applied Biosystems, fabricantes de nuestros secuenciadores. Para obtener la mejor calidad de secuencia y longitud de lectura, recomendamos el uso de químicas Big Dye Terminator, que es lo que usamos en nuestras reacciones de secuenciación. Hay dos químicas estándar disponibles para la secuenciación de plantillas de rutina, Big Dye Terminator v3.1 y 1.1. Los números de pieza se enumeran a continuación:

      Kit de secuenciación de ciclos BigDye ® Terminator v3.1
      (el protocolo se pide por separado p / n 4337035)


      Protocolo

      1. Descongele el número necesario de alícuotas de la solución A y B en hielo. Pulsar-centrifugar en microcentrífuga para recoger las soluciones en el fondo del tubo.

      Ciertos componentes de la Solución A pueden precipitar durante el almacenamiento. Asegúrese de mezclarlo bien antes de ensamblar las reacciones. El rendimiento del kit no se verá comprometido.

      Incubar a 37 ° C durante al menos 2 horas. El tiempo de incubación adicional (máximo 4 horas) a 37 ° C puede aumentar el rendimiento.

      Estas formulaciones permiten un aumento en el volumen "agregado por el usuario" (para plantillas, suplementos, etc.) tolerando hasta un 20% sobre el volumen (30 & mul de reacción en total) sin una caída apreciable en la productividad.

      La plantilla de control DHFR se suministra a 125 ng / & mul. Utilice 2 & mul para la reacción de control positivo. El ADN molde, particularmente el ADN plásmido preparado por mini-prep (por ejemplo, Qiagen) es a menudo la principal fuente de contaminación por ARNasa. Recomendamos encarecidamente agregar 20 unidades de inhibidor de RNasa, murino (NEB # M0314) en cada reacción.

      Para las proteínas diana que requieren un enlace disulfuro, sugerimos complementar las reacciones con el potenciador del enlace disulfuro PURExpress (PDBE, NEB # E6820). Agregue la Solución B a la Solución A, no diluya la Solución B sin tampón. Recomendamos una concentración inicial de 250 ng de ADN molde por reacción de 25 & mul. La cantidad óptima de ADN de entrada se puede determinar configurando múltiples reacciones y titulando la cantidad de ADN molde agregado a la reacción. Normalmente, la cantidad óptima estará en un rango de plantilla de 25-1000 ng. (NEB # E3313) La reacción estándar contiene 60 pmoles de ribosomas en una reacción de 25 & mul. Los ribosomas de control suministrados son suficientes para dos reacciones. Es posible utilizar una cantidad menor de ribosomas, pero la producción de proteínas puede ser menor.

      Recomendamos utilizar una incubadora en lugar de un baño de agua para evitar la evaporación. Algunas reacciones pueden beneficiarse de una hora adicional de incubación para lograr el máximo rendimiento. Algunas proteínas también son más solubles a temperaturas reducidas, sin embargo, las reacciones de incubación por debajo de 37 ° C probablemente reducirán el rendimiento.

      Algunos materiales pueden precipitar durante el almacenamiento a -20 ° C. Asegúrese de que todo se resuspende girando el tubo de reacción después de descongelarlo.

      Los componentes PURExpress están altamente purificados y presentes en cantidades conocidas. La naturaleza reconstituida de este producto lo hace susceptible de modificaciones. Como tal, es fácil de realizar in vitro reacciones de etiquetado con 35 S-metionina para permitir la visualización del producto. También es sencillo complementar las reacciones con un componente en investigación que se cree que tiene un efecto sobre la transcripción o traducción. In vitro El marcaje con 35 S-metionina se puede realizar estableciendo una reacción estándar con la adición de 2 & mul de 35 S-metionina.

      Todos los aminoácidos, incluida la metionina, están presentes en aproximadamente 0,3 mM en PURExpress (con la excepción de NEB # E6840). Los aminoácidos marcados competirán con los aminoácidos normales existentes y la señal observada del marcador depende de la eficacia de incorporación en la proteína de interés. Cuando se suplementa con 1,2 & muM 35 S-L-metionina, observamos niveles de incorporación compatibles con la detección autorradiográfica de la proteína sintetizada. Las reacciones (1 & ndash5 & mul) se pueden resolver directamente mediante SDS-PAGE (sin necesidad de precipitación con acetona), los geles se fijan brevemente en una solución de metanol / ácido acético (45% / 10%) durante 5 minutos a 25 ° C y se secan. sobre papel de filtro (2 horas a 80 ° C). A continuación, el gel seco se expone a una película autorradiográfica (durante la noche a -20 ° C) o se detecta con un fosforimager.


      Ver el vídeo: Hemijske reakcije. Analiza i sinteza - Hemija za 7. razred #26. SuperŠkola (Agosto 2022).