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¿Por qué utilizar ratones transgénicos en modelos de ELA?

¿Por qué utilizar ratones transgénicos en modelos de ELA?



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En el modelo de ratones ALS con SOD1 mutante, se utilizan ratones transgénicos, con inserto de SOD1 mutante humano.

¿Porqué es eso? ¿Por qué no mutar directamente la SOD1 en ratones?

En ratones transgénicos, después de pocas generaciones estos genes humanos se descartan y ya no se presentan… ¿Por qué se descartan? Es la segunda pregunta.

Buscando una respuesta por un tiempo. Muchas gracias.


El uso de un ratón con el reemplazo de uno de sus genes por una versión humana es para imitar mejor el fenotipo de la enfermedad humana o para probar algo sobre la biología del fenotipo humano con investigaciones que no se pueden realizar en humanos.

Los genes y sus correspondientes proteínas o ARN suelen diferir algo entre ratones y humanos. Si desea estudiar si un determinado SNP en un gen (que se encuentra en los seres humanos) es la razón de parte de su fenotipo, es posible que desee utilizar ratones transgénicos para probar hipótesis con diferentes exacerbaciones (tratamientos). Una forma de hacer esto es crear un ratón con el gen humano que reemplace al gen del ratón y otro ratón con el gen humano que contenga el SNP ligado al rasgo.

Si intenta hacer esto con el gen del ratón, no puede estar seguro de que el mismo SNP tenga las mismas consecuencias funcionales. Si no eliminó el gen endógeno del ratón antes de reemplazarlo con la versión humana, nunca estaría seguro de que los fenotipos experimentales observados no estuvieran confundidos por la presencia de ambas copias del gen y sus productos génicos correspondientes activos en el mismo animal. .

En su ejemplo, con SOD1 y ALS, la creación de un ratón humanizado con SOD1 humano permite a los investigadores estudiar más a fondo el mismo producto proteico fabricado en humanos, al mismo tiempo que le dan al ratón tratamientos que no serían éticos en humanos.

Tu comprensión en tu última parte es incorrecta. Los ratones no pierden genes después de algunas generaciones.


El modelo de ratón versátil para la investigación de enfermedades raras

Hasta ahora se han descrito más de 7.000 enfermedades raras (o huérfanas) que afectan a más de 350 millones de personas en todo el mundo. Desafortunadamente, menos del 10% de estas enfermedades tienen un tratamiento aprobado y el desarrollo de nuevas terapias se ha convertido en una prioridad ampliamente reconocida por muchas autoridades nacionales.

El desarrollo de una nueva terapia para una enfermedad rara plantea algunos desafíos únicos, como la dificultad de realizar ensayos clínicos en poblaciones de pacientes muy pequeñas. Como consecuencia de estas limitaciones clínicas, los modelos animales y los ratones diseñados específicamente y genéticamente se han convertido en uno de los activos más valiosos en todas las fases del desarrollo preclínico de fármacos huérfanos, desde el descubrimiento y la validación de genes hasta los estudios de seguridad y eficacia, y están desempeñando un papel cada vez más importante en impulsando las decisiones de experimentación clínica para esta clase de terapias.

Comprensión de la enfermedad: modelos de ratón en el descubrimiento y validación de genes de enfermedades raras

Se ha demostrado que las mutaciones genéticas causan más del 80% de las enfermedades raras. Armados con esta información genómica, los científicos han dirigido sus esfuerzos para desarrollar in vitro y en vivo modelos para comprender los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades. Debido a las tecnologías establecidas para la manipulación del genoma y su alta conservación genómica y funcional en humanos, el modelo de ratón ha sido, con mucho, el organismo más utilizado en el desarrollo de fármacos huérfanos (Vaquer et al., 2013).

Los modelos de ratón representan herramientas muy convenientes para comprender cómo las mutaciones específicas identificadas en pacientes pueden influir en la función de órganos y tejidos específicos. Esto es extremadamente importante en los casos en que más de un sistema se ve afectado por una sola mutación, como mutaciones con efectos pleiotrópicos o que afectan el metabolismo (Ittisoponpisan et al., 2017). Además, en muchos casos, la introducción de una mutación en el genoma del ratón correspondiente a una variante asociada a una enfermedad humana da como resultado una cepa de ratón que exhibe al menos algunos de los fenotipos clínicos (Lutz, 2018).

Los modelos de ratón también se utilizan ampliamente para simplificar y enfocar la investigación genómica dirigida a identificar nuevos genes de enfermedades raras mediante el análisis de grandes reordenamientos genómicos que conducen a variaciones en el número de copias. En este caso, el propósito principal del modelo de ratón es restringir la región genómica asociada con una enfermedad específica a uno o unos pocos genes analizando los datos asociados con fenotipos de ratón previamente descritos y correlacionarlos con la manifestación patológica humana. Con este enfoque, los investigadores han podido vincular la aparición de ciertos síntomas a genes específicos. Por ejemplo, se identificaron variaciones en el número de copias asociadas con convulsiones en un momento particular del día en humanos porque interrumpieron el ciclo circadiano en ratones (Webber et al., 2009 Boulding y Webber, 2012). McGary y sus colegas describen una extensión intrigante de este enfoque, sugiriendo que el análisis y la correlación de fenotipos ortólogos (fenólogos) pueden usarse para identificar nuevos fenotipos causantes de enfermedades (McGary et al., 2010).

Los modelos de ratón también se utilizan para investigar la relación entre diferentes enfermedades y explorar el papel de los modificadores genéticos en la progresión de la enfermedad. En un ejemplo revelador, Tayebi y sus colegas cruzaron un modelo de ratón de la enfermedad de Gaucher con mutaciones en el gen Gba1 con un modelo bien caracterizado de la enfermedad de Parkinson y rsquos, mostrando un vínculo directo entre GBA1 y las sinucleinopatías, y abriendo el camino hacia una nueva dirección de investigación. para esta clase de enfermedades (Tayebi et al., 2017).

Evaluación de la seguridad y la eficacia mediante modelos de ratón

El desarrollo de terapias para enfermedades raras se basa en gran medida en los datos de seguridad y eficacia generados en modelos animales. Si se utilizan modelos incorrectos o subóptimos, o el en vivo los experimentos no están correctamente diseñados, el valor de los datos generados en la fase preclínica es limitado y los resultados tienen un bajo valor de traducción.

Desafortunadamente, el uso de modelos de ratón subóptimos afecta a un número nada despreciable de estudios publicados. El modelo transgénico TDP-43 de ELA representa un ejemplo informativo de un modelo de ratón preclínico que no estuvo a la altura de las expectativas en el entorno clínico. En el informe inicial que describe este modelo, los investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington mostraron la presencia de características distintivas de la ELA y atribuyeron a la degeneración de las neuronas motoras un papel en la letalidad del modelo (Wegorzewska et al., 2009). La introducción de un nuevo modelo en el campo de la ELA fue recibida con mucho entusiasmo por muchos investigadores que tuvieron que depender principalmente de modelos transgénicos desarrollados alrededor de otra mutación conocida de la ELA, a saber, los ratones transgénicos SOD. Varios laboratorios comenzaron de inmediato a utilizar la nueva línea para las pruebas preclínicas de drogas. Sin embargo, resultó que la letalidad que caracteriza a la línea TDP-43 es completamente independiente de la disfunción de la neurona motora, y mucho menos de la degeneración, pero es causada por una obstrucción intestinal, como lo demostraron los investigadores del Laboratorio Jackson y los colaboradores de ALS Therapy Development. Instituto (Hatzipetros et al., 2014).

En segundo lugar, es fundamental definir medidas clínicamente relevantes para evaluar el resultado del tratamiento farmacológico. Si una terapia aumenta la supervivencia pero no mejora los síntomas de la enfermedad, puede que no sea deseable para el desarrollo clínico. En este contexto, es necesario identificar los fenotipos del modelo de ratón que corresponden a manifestaciones clínicas específicas y medirlos repetidamente durante el tratamiento para evaluar la eficacia terapéutica del fármaco candidato. Por ejemplo, una buena medida de la actividad neuromuscular que puede usarse para monitorear la efectividad de un tratamiento en cualquier enfermedad que exhiba fenotipos de función motora es la medición electrofisiológica del potencial de acción del músculo compuesto, una prueba que se ha adaptado a experimentos con ratones de la clínica. (Bogdanik et al., 2015).

Resumen y conclusiones

Mediante el uso del modelo de ratón más apropiado, el diseño del régimen de tratamiento que refleja el plan clínico y la combinación de la medición repetida durante la vida de fenotipos clínicamente relevantes con el análisis patológico post-mortem, los investigadores preclínicos pueden obtener conocimientos críticos sobre la eficacia y seguridad de la tratamiento candidato, refinarlo (si es necesario) y aumentar sus posibilidades de éxito en el entorno clínico.

JAX proporciona a los investigadores de todo el mundo acceso a más de 11.500 modelos, incluidos modelos de fenotipo de enfermedad y modelos únicos desarrollados para estudios específicos y preclínicos. en vivo estudios para alcanzar sus hitos preclínicos. Para obtener más información sobre los distintos modelos de modelos y preclínicos en vivo estudios disponibles de JAX para ayudar en su investigación de enfermedades raras, visite jax.org/rare-disease.

Asegúrese de unirse a nosotros en uno de los dos eventos del Simposio europeo del Laboratorio Jackson "Cómo utilizar modelos de ratón en la investigación de enfermedades raras y el desarrollo de fármacos preclínicos" en Basilea, Suiza, el 25 de junio y Cambridge, Reino Unido, el 27 de junio de 2019.

Recursos recomendados

Referencias

Bogdanik LP, Osborne MA, Davis C, Martin WP, Austin A, Rigo F, Bennett CF, Lutz CM. 2015. El oligonucleótido antisentido postsintomático sistémico rescata el retraso en la maduración de la unidad motora en un nuevo modelo de ratón para la atrofia muscular espinal tipo II / III. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43): E5863-72. [PMID: 26460027]

Boulding H, Webber C. 2012. Asociación objetiva a gran escala de fenotipos de ratón con síntomas humanos a través de la variación estructural identificada en pacientes con trastornos del desarrollo. Hum Mutat. 33 (5): 874-83. [PMID: 22396327]

Hatzipetros T, Bogdanik LP, Tassinari VR, Kidd JD, Moreno AJ, Davis C, Osborne M, Austin A, Vieira FG, Lutz C, Perrin S. 2014. Los ratones C57BL / 6J congénicos Prp-TDP43A315T desarrollan neurodegeneración progresiva en el plexo mientérico del colon sin exhibir características clave de ELA. Brain Res. 10 1584: 59-72. [PMID: 24141148]

Ittisoponpisan S, Alhuzimi E, Sternberg MJ, David A. 2017. Panorama de las proteínas pleiotrópicas que causan enfermedades humanas: conocimientos de biología estructural y de sistemas. Hum Mutat. 38 (3): 289-296. [PMID: 27957775]

Ludolph AC, Bendotti C, Blaugrund E, Chio A, Greensmith L, Loeffler JP, Mead R, Niessen HG, Petri S, Pradat PF, Robberecht W, Ruegg M, Schwalenst & oumlcker B, Stiller D, van den Berg L, Vieira F, von Horsten S. 2010. Directrices para la investigación animal preclínica en ELA / EMN: una reunión de consenso. Scler lateral amiotrófico. 11 (1-2): 38-45. [PMID: 20184514]

Lutz C. 2018. Modelos de ratón de ELA: pasado, presente y futuro. Brain Res. 151693 (Parte A): 1-10. [PMID: 29577886]

McGary KL, Park TJ, Woods JO, Cha HJ, Wallingford JB, Marcotte EM. 2010. Descubrimiento sistemático de modelos de enfermedades humanas no obvias a través de fenotipos ortólogos. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14): 6544-9. [PMID: 20308572]

Moretti P, Levenson JM, Battaglia F, Atkinson R, Teague R, Antalffy B, Armstrong D, Arancio O, Sweatt JD, Zoghbi HY. 2006. El aprendizaje, la memoria y la plasticidad sináptica se ven afectados en un modelo de ratón del síndrome de Rett. J Neurosci. 26 (1): 319-27. [PMID: 16399702]

Tayebi N, Parisiadou L, Berhe B, Gonzalez AN, Serra-Vinardell J, Tamargo RJ, Maniwang E, Sorrentino Z, Fujiwara H, Gray RJ, Hassan S, Blech-Hermoni YN, Chen C, McGlinchey R, Makariou-Pikis C , Brooks M, Ginns EI, Ory DS, Giasson BI, Sidransky E. 2017. La haploinsuficiencia de glucocerebrosidasa en ratones A53T y alfa-sinucleína afecta el inicio y el curso de la enfermedad. Mol Genet Metab. 122 (4): 198-208. [PMID: 29173981]

Vaquer G, Rivi & egravere F, Mavris M, Bignami F, Llinares-Garcia J, Westermark K, Sepodes B. 2013. Modelos animales para enfermedades raras metabólicas, neuromusculares y oftalmológicas. Nat Rev Drug Discov. 12 (4): 287-305. [PMID: 23493083]

Webber C, Hehir-Kwa JY, Nguyen DQ, de Vries BB, Veltman JA, Ponting CP. 2009. Forjar vínculos entre las NVC asociadas con el retraso mental humano y los modelos de eliminación de genes de ratón. PLoS Genet. 5 (6): e1000531. [PMID: 19557186]

Wegorzewska I, Bell S, Cairns NJ, Miller TM, Baloh RH. 2009. Los ratones transgénicos mutantes TDP-43 desarrollan características de ELA y degeneración lobular frontotemporal. Proc Natl Acad Sci U S A. 3106 (44): 18809-14. [PMID: 19833869]


Patología de la enfermedad de Alzheimer en modelos de ratones transgénicos APOE: quién, qué, cuándo, dónde, por qué y cómo

El enfoque en las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares no ha dado lugar a tratamientos que modifiquen la enfermedad de Alzheimer (EA) en las últimas décadas, a pesar de los estudios exitosos en modelos preclínicos de ratones. Esta inconsistencia ha provocado un renovado enfoque en mejorar la fidelidad y confiabilidad de los modelos de mouse AD, con opiniones dispares sobre cómo se puede lograr esta mejora. Sin embargo, los efectos interactivos de las variables biológicas universales de la EA, que incluyen la edad, el genotipo APOE y el sexo, a menudo se pasan por alto. La edad es el mayor factor de riesgo de EA, mientras que el alelo ε4 del gen APOE humano, que codifica la apolipoproteína E, es el mayor factor de riesgo genético. El sexo es la última variable biológica universal de la EA, ya que las mujeres desarrollan EA en casi el doble de la tasa de los hombres y, lo que es más importante, el sexo femenino exacerba los efectos de APOE4 sobre el riesgo de EA y la tasa de deterioro cognitivo. Por lo tanto, esta revisión evalúa la importancia del contexto para comprender el papel de APOE en modelos preclínicos de ratón. Específicamente, detallamos cómo la patología de la EA humana se refleja en los modelos actuales de ratones transgénicos ("Qué") y describimos la necesidad crítica de introducir APOE humano en estos modelos de ratones ("Quién"). A continuación, describimos diferentes métodos para introducir APOE humano en ratones ("Cómo") y destacamos los esfuerzos para desarrollar modelos de expresión de apoE humanos definidos temporalmente y específicos de la ubicación ("Cuándo" y "Dónde"). Concluimos con la importancia de elegir el modelo de ratón APOE humano relevante para la pregunta que se aborda, utilizando como ejemplo la selección de modelos transgénicos para probar terapias dirigidas a apoE ("Por qué").

Palabras clave: APOE-TR modelo de ratón APOE4 y riesgo de EA Enfermedad de Alzheimer (EA) EFAD-Tg modelo de ratón apoE como diana terapéutica apolipoproteína E familiar AD ratones transgénicos (FAD-Tg) sexo y riesgo de EA.

Copyright © 2020 Los Autores. Publicado por Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Declaracion de conflicto de interes

Declaración de intereses en conflicto Los autores no tienen intereses en conflicto que revelar.


Del ratón al hombre: modelos animales y modelos celulares en el estudio del autismo

Los sistemas de modelos no humanos nos permiten mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad en muchos trastornos. Estos modelos proporcionan una herramienta invaluable en la identificación de objetivos para el desarrollo terapéutico y de fármacos para uso humano. El uso de roedores (por ejemplo, ratones y ratas) y modelos de células madre está ampliamente difundido a lo largo de la investigación del autismo, pero ¿qué descubrimientos ha permitido el uso de estos y cómo han llevado a tratamientos terapéuticos?

¿Por qué utilizar modelos animales?

En la investigación del autismo, los modelos animales proporcionan una herramienta valiosa para llenar el vacío en el conocimiento sobre los mecanismos cerebrales alterados que conducen a la manifestación de los déficits conductuales característicos del trastorno del espectro autista (TEA).

La generación de modelos animales para el TEA, se basa en los hallazgos derivados de estudios genéticos y ambientales, que nos informan sobre las agresiones responsables del fenotipo TEA. Los insultos (p. Ej., Mutación genética) se imitan en las especies elegidas para modelar los déficits que observamos en los individuos con TEA y permitir una investigación metódica de los mecanismos alterados a nivel molecular, celular y cerebral.

Por ejemplo, los estudios en modelos animales pueden abordar preguntas sobre los efectos biológicos de una mutación genética específica en (1) la fuerza de la interacción entre las células nerviosas (conocida como plasticidad sináptica), (2) la integridad de la comunicación entre las regiones del cerebro que trabajan juntas para regular conductas específicas (conocidas como circuitos cerebrales) y (3) sobre conductas cognitivas, motoras y sociales. Las respuestas a estas preguntas proporcionan la plataforma para estudios futuros centrados en el descubrimiento y el desarrollo de fármacos.

Los modelos animales también se están utilizando para probar biomarcadores traducibles, que son medidas que pueden evaluarse de manera comparable en sujetos humanos y animales. Una vez identificados, estos biomarcadores pueden servir como herramientas para examinar la eficacia de posibles terapias en modelos animales, predecir su efecto en sujetos humanos e informar los ensayos clínicos.

Investigación en el Seaver Autism Center

En el Centro de Investigación del Autismo de Seaver, estamos caracterizando modelos de ratones y ratas con mutaciones en varios genes de riesgo de TEA, incluido el SHANK3, que conduce al síndrome de Phelan McDermid (PMS) y en el Gen FMR1, que conduce al síndrome de X frágil. Al adoptar el enfoque descrito anteriormente, descubrimos que el tratamiento con IGF-1 en un modelo de ratón con una mutación en el Vástago3 gen mejora la plasticidad sináptica y los déficits motores.

Estos hallazgos formaron la base de los ensayos clínicos con IGF-1 en personas con PMS, que establecieron la viabilidad del tratamiento con IGF-1 en PMS, proporcionando una prueba de concepto para avanzar en el conocimiento sobre el desarrollo de tratamientos específicos para la disfunción sináptica asociada con el TEA.

Otro ejemplo proviene de nuestro estudio reciente sobre un modelo de rata para TEA, el Vástago3-rata deficiente, que también alberga una mutación en el Vástago3 gene. Estas ratas exhiben comportamiento social y déficit de atención, recapitulando las características neuropsiquiátricas del síndrome premenstrual. La naturaleza de los déficits del modelo nos llevó a probar el efecto de la hormona prosocial, la oxitocina, sobre la plasticidad sináptica y los déficits conductuales.

Encontramos que la oxitocina mejoró significativamente la memoria social, la atención y los déficits de plasticidad sináptica, lo que sugiere que la oxitocina puede tener un potencial terapéutico para los déficits sociales y no sociales en personas con SPM, lo que respalda nuestros ensayos clínicos en curso con oxitocina en estas personas. En el Centro, también estamos utilizando este modelo para desarrollar biomarcadores basados ​​en electroencefalogramas (EEG) que podemos emplear en estudios futuros para probar la eficacia de terapias novedosas.

Células madre

El estudio de las células madre también ha ganado mucha atención en la investigación del autismo. Las células madre se pueden generar a partir de muestras de sangre o piel y diferenciarse en células nerviosas, que se examinan en el laboratorio. Las células nerviosas derivadas de células madre superan el problema del acceso limitado a las neuronas vivas, permiten la identificación de mecanismos celulares y moleculares alterados y permiten probar la eficacia de los fármacos a nivel individual.

Las células madre también son eficientes para realizar un cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas, lo que puede acelerar el descubrimiento de nuevas moléculas con potencial efecto terapéutico. En el Seaver Center, continuamos desarrollando el uso de células madre en la investigación del autismo e inscribimos a todas las personas afectadas que visitan nuestra clínica, a sus padres y, cuando están disponibles, a sus hermanos no afectados en esta investigación.

Sintonice el Facebook del Hospital Mount Sinai el 5 de junio a las 11 a. M. EST / 3 p. M. GMT para escucharme a mí mismo, el Dr. Harony-Nicolas, hablar con más profundidad sobre el tema de los modelos animales y celulares utilizados en la investigación del autismo en el Centro Seaver.

Obtenga más información sobre el Seaver Autism Center en www.seaverautismcenter.org

Descubra más sobre la investigación actual en curso en este campo en Autismo molecular.


Resultados

Un fenotipo similar a ALS de ratones que tienen una sola mutación TDP-43 N390D, pero no una mutación A315T

Generamos líneas de ratón que llevan el knock-in homólogo de sustituciones de bases asociadas a ALS humana, A315T y N390D, respectivamente. El TDP-43 A315T se identificó en todos los miembros afectados, pero no en los sujetos de control sanos de varias familias europeas [27, 33], mientras que N390D se identificó en un paciente esporádico con ELA-TDP de Quebec [33]. Sustituimos el nucleótido conservado G en la posición 943 con A (para A315T) o A en la posición 1168 con G (para N390D) en el ratón. tardbp gen (Fig. 1a). Aunque los pacientes con ELA-TDP portaban la mutación A315T o N390D en un solo alelo [27, 33], intentamos obtener descendencia homocigótica para el análisis cruzando los ratones knock-in heterocigotos. Los ratones A315T / + o N390D / + fueron fértiles y los ratones machos tienen un comportamiento de cortejo normal. Sin embargo, a diferencia de los ratones homocigotos A315T / A315T, ningún ratón homocigoto N390D / N390D pudo sobrevivir hasta las 3 semanas de edad. Paralelamente, la mayoría de las crías recién nacidas muertas fueron genotipadas como N390D / N390D y el resto fueron N390D / + (ver archivo adicional 1: Figura S1a). No obstante, la cantidad de proteína TDP-43 en la médula espinal de los ratones homocigotos N390D / N390D fue significativamente mayor que la de los ratones de tipo salvaje (archivo adicional 1: Figura S1c). Por lo tanto, la causa de muerte de las crías N390D / N390D podría resultar de un efecto letal de la mutación homocigótica N390D / N390D en el desarrollo temprano de los ratones, como también se observó para el modelo de ratón knock-in TDP-43 A315T humano homocigoto generado por el grupo de Stribl. [61]. Además, la proporción de macho a hembra de los cachorros N390D / + sobrevividos fue de 1 a 2,6 aproximadamente (archivo adicional 1: Figura S1b). En particular, las edades de inicio de la enfermedad de los ratones hembra N390D / + individuales fueron muy variables, como se refleja en la prueba de la varilla giratoria, y el tiempo de supervivencia de los ratones hembra N390D / + fue significativamente más largo que los machos (archivo adicional 1: Figura S1d), con un promedio la edad es de 25,5 ± 6 meses. Alrededor del 30% de los ratones hembra N390D / + eran indistinguibles de los ratones hembra + / +, lo que sugiere que el estrógeno podría ejercer un efecto protector [20, 47, 50]. En base a lo anterior, nos concentramos en el uso de los ratones macho N390D / + para todos los análisis que se describen a continuación. Aunque se desconocía la (s) causa (s) de su eventual muerte, los ratones macho N390D / + derivados de 2 líneas ESC independientes (# 108 y # 361) mostraron una vida útil más corta que los ratones macho + / + o A315T / +, con edad media de 19,5 ± 2 meses (fig. 1b). Al igual que los ratones heterocigotos Q331K / + estudiados por White et al., [72] los ratones macho N390D / + de cualquier línea tenían un peso corporal similar al de los ratones macho + / + (archivo adicional 1: Figura S1e), aunque se observó una pérdida de peso notable. observados en sus restos (Fig. 1c), posiblemente en parte como resultado de la falta de nutrición en la etapa final de sus vidas. Estos datos indican que la pérdida de peso corporal no fue el evento patológico inicial de ALS en ratones macho N390D / +.

Se utilizaron pruebas de Rotarod y T-maze para evaluar si los ratones knock-in desarrollarían fenotipos similares a ALS y / o FTLD. Sorprendentemente, mientras que los ratones macho heterocigotos N390D / + de la línea # 108 o # 361 exhibieron una disfunción motora significativa a las edades de 6 meses y mayores, los ratones macho A315T heterocigotos y homocigotos parecían indistinguibles de los compañeros de camada + / + (Fig. 2a). No obstante, los ratones machos jóvenes y viejos N390D / + no desarrollaron un rendimiento deficiente en la tarea del laberinto en T, como se muestra en el archivo adicional 2: Figura S2a. Además, no hubo pérdida de neuronas en la circunvolución dentada (DG), las regiones CA1 y CA3 del hipocampo de los ratones macho N390D / + en comparación con los ratones macho + / + (consulte el archivo adicional 2: Figura S2b). Con el tiempo, los ratones macho N390D / + de la línea # 108 o # 361 comenzaron a mostrar un agarre anormal de las extremidades traseras y cifosis alrededor de los 8 meses de edad, como se ejemplifica en las Fig.2b yc, y mostraron una marcha espasmódica y temblorosa en 18 meses y más (Archivo adicional 9: Película S1 y Archivo adicional 10: Película S2), en comparación con los ratones + / + de la misma edad (Archivo adicional 11: Película S3). Dado que la parálisis ocurrió en la pata trasera de los ratones N390D / +, supusimos que las patas traseras se vieron afectadas antes que las patas delanteras. Asimismo, analizamos principalmente el músculo sóleo, que fue uno de los principales músculos que controlan la marcha, la carrera y el salto, siguiendo el estudio de Tremblay et al. [62] sobre la denervación de las uniones neuromusculares en ratones SOD-1. A diferencia de los ratones machos jóvenes N390D / +, los ratones macho N390D / + de 12 y 24 meses de edad exhibieron una atrofia muscular esquelética significativa en comparación con los ratones + / + o A315T / +, representada por la disminución del peso húmedo de sóleo y reducción del volumen del músculo de la pantorrilla (fig. 2d y e). La masa húmeda era un signo relativamente simple y preparatorio para la atrofia muscular como también lo usaban otros, por ejemplo. Goto et al., [28], Dang et al., [19], etc. Además, aunque la inervación de las uniones neuromusculares (NMJ) en el músculo sóleo de ratones N390D / + de 3 meses de edad parecía + / + ratones (color amarillo, Fig.2f), se detectó denervación del NMJ del músculo sóleo en ratones N390D / + a la edad de 6 meses, como se ejemplifica en las imágenes representativas del panel inferior en la Fig.2f, por aproximadamente el 23% en comparación con los ratones macho + / + (Fig. 2g). La extensión de la denervación de NMJ aumentó progresivamente con el envejecimiento adicional de los ratones N390D / + (datos no mostrados). Basándonos en las similitudes de los ratones macho N390D / + derivados de las líneas # 108 y # 361 con respecto a sus curvas de supervivencia, cambios de peso corporal y resultado de la prueba de varilla giratoria, mezclamos ratones usados ​​de las dos líneas para el siguiente análisis de patología molecular y celular. La misma estrategia se aplicó al análisis de ratones A315T / + y + / +.

Patología molecular y celular de los ratones macho TDP-43 (N390D / +)

Acumulación, escisión mejorada, fosforilación elevada y mayor insolubilidad de la médula espinal TDP-43

Los cambios en una variedad de características moleculares y celulares se asociaron con los fenotipos similares a ALS de los ratones macho N390D / + descritos anteriormente. Primero, a diferencia de los ratones macho A315T / +, el nivel de expresión de la proteína TDP-43 se elevó en la médula espinal, pero no en otros tejidos, de los ratones macho N390D / +, y se elevó progresivamente con la edad en la médula espinal, p. recién nacido, 3, 6, 12 y 24 meses (Fig.3a yb, Fig.4b y archivo adicional 4: Figura S4a), a pesar de los niveles similares de tardbp mARN (consulte el archivo adicional 3: Figura S3, ayb). En segundo lugar, hubo una mejora dependiente de la edad de la escisión de TDP-43 para generar fragmentos de 35 kDa y 25 kDa en la médula espinal de ratones N390D / + post-sintomáticos (Fig.3b), que era característico de la médula espinal de los pacientes con ELA-TDP [49, 56]. La escisión mejorada de TDP-43 estuvo acompañada por una fracción significativamente mayor de TDP-43 / TDP-35 / TDP-25 insoluble en los extractos celulares de la médula espinal de ratones machos N390D / + a la edad de 6 meses y más (Fig. .3b y archivo adicional 3: Figura S3c). En tercer lugar, la cantidad de TDP-43 fosforilado (pTDP-43), que se identificó como un componente de las inclusiones positivas de ubiquitina (UPI) en las neuronas enfermas de ELA y FTLD [48], aumentó significativamente en la médula espinal ( consulte el archivo adicional 4: Figura S4a), pero no el prosencéfalo (consulte el archivo adicional 4: Figura S4b), de ratones a la edad de 12 meses y más.

Análisis de firma de patología de TDP-43 en la médula espinal de ratones machos knock-in N390D / +. a Expresión de TDP-43 en diferentes tejidos de ratones macho A315T / + (panel izquierdo) y N390D / + de 6 meses (panel derecho). El análisis estadístico se muestra en los diagramas de caja (mínimo a máximo con todos los puntos). B Expresión de TDP-43 (incluidos TDP-35 y TDP-25) en las fracciones solubles e insolubles de la médula espinal. El pliegue relativo del TDP-43 de la médula espinal total se ejemplifica en los diagramas de caja superior de la derecha (con todos los puntos). El gráfico de barras apiladas inferior (media ± DE) indica las proporciones de TDP-43 soluble e insoluble en la médula espinal de ratones macho + / + y N390D / +. C Co-tinción de inmunofluorescencia de secciones lumbares de la médula espinal de ratones machos + / + y N390D / + usando anti-TDP-43 (verde), anti-ubiquitina (Ub, gris) y anti-ChAT (marcador de neurona motora roja). DAPI (azul) indica la ubicación de los núcleos. La imagen de las neuronas motoras se amplía desde el asta ventral de la médula espinal. Es probable que las señales parecidas a vasos se deban a la tinción de los axones de las neuronas motoras. Los cuadros de línea blanca en la primera columna indican las regiones ampliadas de los paneles de la derecha. Las barras de escala son de 50 μm. D Comparación estadística del número de motoneuronas ChAT (+) por sección, el% de ubiquitina (+) MN entre el ChAT (+) MN y el% de ChAT (+) MN con ubiquitina grande (+) TDP-43 (+ ) Agregados MN. mi La distribución citosólica y nuclear de la médula espinal TDP-43 en los ratones machos N390D / + y + / + a diferentes edades. Se utilizaron histona H4 (marcador nuclear) y ɑ-tubulina (marcador citosólico) para validar el fraccionamiento de extractos celulares. El gráfico de dispersión (media ± DE) deducido de los datos de transferencia Western se muestra debajo de las transferencias. norte = 6 (3 ratones de cada una de las dos líneas independientes) por grupo en a, B y mi. N ≧ 3 (elegido al azar de cada una de las dos líneas independientes) por grupo en C y D. Significativamente diferentes representados en a-mi: *pag & lt 0.05, **pag & lt 0.01, #pag & lt 0,001

Efectos de la mutación de TDP-43 (N390D) sobre la autofagia y la expresión de Bcl-2. a-b Expresión de LC3-I y LC3-II (a) y proteína TDP-43 (B) en la médula espinal de ratones machos + / +, A315T / + y N390D / + a diferentes edades. Las transferencias se ejemplifican a la izquierda, y los análisis estadísticos se muestran en el diagrama de caja de la derecha (mínimo a máximo con todos los puntos). C El esquema de la izquierda es el empalme alternativo de Bcl-2 pre-ARNm para generar el Bcl-2-201 mRNA (las líneas negras) y Bcl-2-202 ARNm (las líneas rojas). Las 3 flechas (P1, P2 y P3) indican los cebadores utilizados para RT-PCR. Las líneas azules indican la ubicación de la región de codificación. Las cajas con diferentes colores son los diferentes exones. Las flechas en el marco punteado son los cebadores (P2, P3) utilizados para detectar el Bcl-2-201 ARNm. La expresión de Bcl-2-201 ARNm y proteína Bcl-2 en la médula espinal de ratones machos A315T / +, N390D / + y + / + a diferentes edades se ejemplifican en los dos paneles de arriba a la derecha, con el análisis estadístico de los niveles de Bcl-2 ARNm y proteína Bcl-2 que se muestran en los dos diagramas de caja de la parte inferior derecha (mínimo a máximo con todos los puntos). D Los cambios de la relación relativa de los dos Bcl-2 isoformas de ARNm. norte = 4 (2 de cada una de las dos líneas independientes) por grupo. mi Comparación de los niveles de expresión de Bcl-2 en células N2a transfectadas. Los niveles de Bcl-2El ARNm -201 y la proteína Bcl-2 se analizaron mediante RT-PCR (paneles de la izquierda) y mediante transferencia Western (panel superior derecho), respectivamente. El análisis estadístico de los niveles de Bcl-2 El ARNm y la proteína Bcl-2 están en los 2 gráficos de puntos inferiores a la derecha (media ± DE). norte = 6 (3 de cada una de las dos líneas independientes) por grupo en a y C. Significativamente diferentes representados en a-mi: *pag & lt 0.05, **pag & lt 0.01, #pag & lt 0,001

Deslocalización dependiente de la edad de TDP-43 y pTDP-43, acumulación de proteínas ubiquitinadas en MN de la médula espinal y pérdida de MN de la médula espinal

Una característica de la patogénesis de la ELA es la formación de grandes agregados citosólicos de TDP-43 (+), ubiquitina (+) y el agotamiento del TDP-43 nuclear en las neuronas motoras enfermas [48]. No se comprende bien la importancia patogénica de estos agregados con respecto al inicio y / o progresión de las enfermedades. También se identificó un espectro completo de características patológicas dependientes de la edad de TDP-43 desarrolladas en las neuronas motoras del cuerno ventral en la médula espinal de los ratones macho N390D / + mediante tinción por inmunofluorescencia (IF) (Fig. 3c yd). Dado que las neuronas del asta dorsal no eran neuronas motoras, no centramos nuestro análisis en el asta dorsal de la médula espinal. En primer lugar, el anti-ChAT de las secciones de la médula espinal mostró que había una pérdida de MN de la médula espinal dependiente de la edad en los ratones N390D / +. En comparación con los ratones + / + y A315T / +, la pérdida fue de casi el 30% a la edad de 6 meses, y aumentó al 62% a los 12 meses y al 77% a los 24 meses de edad (gráfico de puntos de dispersión superior en la Fig. . 3d). En segundo lugar, el nivel de proteínas ubiquitinadas aumentó en el ChAT (+) MN de la médula espinal de 6 meses o más, p. Ej. 24-month old, mice, and most of which were in the cytosol (Fig. 3c, left lower scatter dot plot in Fig. 3d and Additional file 4: Figure S4c). Thirdly, a portion of the TDP-43 was mislocalized to the cytosol in the spinal cord ChAT(+) MN of 6-month old N390D/+ mice without forming large aggregates (diameter > 2 μm) (Fig. 3c). Larger TDP-43(+) aggregates appeared in the cytosol of spinal cord MN of the older (12-month and 24-month of age) N390D/+ mice, and they were colocalized with the ubiquitinated proteins (Fig. 3c and right lower scatter dot plot in Fig. 3d). Use of different primary antibodies for immunostaining of different samples generated different patterns of aggregate formation, thus excluding the possibility of the presence of signals from auto-fluorescence of lipofuscin. The IF data were supported by Western blotting analysis of fractionated spinal cord extracts. As shown, the fraction of the cytosolic TDP-43 of spinal cord was

15% at the age of 6 months and it increased to

40% by 24 months (Fig. 3e). Furthermore, IF staining of the spinal cord sections showed that there was an age-dependent increase of pTDP-43 in the spinal cord (Additional file 4: Figure S4c) and spinal cord MN (Additional file 4: Figure S4d-g) of N390D/+ male mice. Note that there were also strong signals of Ub and pTDP-43 in the dorsal horn of the spinal cord. Finally, pTDP-43 was also colocalized with ubiquitin partially in the spinal cord MN of 12-month old male N390D/+ mice and this colocalization increased greatly at the age of 24 months (Additional file 4: Figure S4 f and g).

Increasing evidence showed that glial pathology would mediate the disease progression of ALS via reactive astrocytes and microglial activation [52]. In particular, studies of the reactive astrocytes surrounding the degenerating motor neurons in the spinal cord of ALS suggested a crucial role of astrogliosis in ALS pathology [52]. Unlike most of ALS transgenic mouse models displaying strong signal of GFAP in the mouse spinal cord or cortex sections at early stage of pathogenesis refs in review [64], astrogliosis and microgliosis were not seen in the spinal cord sections of 6-month old N390D/+ mice. However, significant astrogliosis was detected in the spinal cord of aged N390D/+ mice (Additional file 5: Figure S5), suggesting the existence of a threshold effect so that the gliosis was moderate in the young N390D/+ male mice.

Where ALS disease begins has remained argumentative. One of the hypotheses is “dying-back”, in which ALS begins within the lower motor neurons (LMN) and then the pathology spreads from LMN to the upper motor neurons (UMN) [15, 17, 66]. Notably, in our study, while there was already 30% loss of motor neurons in the lumbar region of the spinal cord of N390D/+ male mice at the age of 6 months (Fig. 3d), the motor cortex, especially the primary motor cortex, only exhibited significant loss of NeuN(+) neurons at the age of 24 months old but not 3 months and 6 months (Additional file 4: Figure S4 h). This pattern of pathogenesis appeared to be similar to the “dying-back” hypothesis.

Alteration of autophagy and proteasome activity

The above data clearly revealed abnormal intracellular localization and aggregation of TDP-43 in the spinal cord of the N390D/+ mice in concert with the mis-regulation of TDP-43 metabolism. The occurrence of TDP-43 protein aggregates was known to be countered by the combined actions of autophagy and the ubiquitin proteasome system (UPS) [57]. We therefore examined the expression patterns of autophagy proteins and the activities of proteasome in the forebrain and the spinal cord. As shown in Fig. 4a, while the ratio of LC3-II/ LC3-I in the spinal cord of 3-month old N390D/+ mice was higher than that of A315T/+ or +/+ mice, it decreased during the post-symptomatic stage to a level significantly lower than those observed in the 6-month old A315T/+ and +/+ mice. In addition, the amount of the classical receptor p62 of autophagy also decreased in the spinal cord, but not the forebrain, of 12-month and 24-month old N390D/+ male mice (Additional file 6: Figure S6, a and b). The proteasome activities in the spinal cord, but not the forebrain, of symptomatic (6- and 24-month old) N390D/+ mice were enhanced when compared to the age-matched +/+ mice and 3-month old N390D/+ mice (Additional file 6: Figure S6, c and d). The data described above together demonstrate the presence of TDP-43 dependent pathology of the autophagy system in the spinal cord of the symptomatic N390D/+ mice.

Increase of spinal cord Bcl-2 protein as a consequence of mis-regulation of Bcl-2 pre-mRNA splicing in N390D/+ male mice

Among the regulators of the autophagy pathway is the Bcl-2/Beclin-1 complex [43] and Bcl-2 has been reported it involves in neuron survival [51]. Significantly, while there was no difference between the levels of spinal cord Bcl-2 protein among the newborn of +/+, A315T/+ and N390D/+ male mice, the amount of spinal Bcl-2 of N390D/+ mice was higher than that of the +/+ or A315T/+ mice by approximately 1.5, 2, and 4-fold at the ages of 3, 6, and 12 months, respectively, in parallel to the increase of the spinal TDP-43 protein (Fig. 4b and c, Additional file 7: Figure S7a). Bcl-2 mRNA is one of the potential neuronal RNA targets of TDP-43 [58], we thus suspected that the higher levels of Bcl-2 protein in the N390D/+ spinal cord might be at least in part due to mis-regulation of Bcl-2 pre-mRNA splicing. Ratón Bcl-2 mRNA consists of 2 splicing variants, Bcl-2-201 and Bcl-2-202 (Ensembl), the former of which encodes the well-studied Bcl-2 protein (NP_033871 from NCBI). Indeed, there was an excellent correlation between the age-dependent increase of spinal Bcl-2 protein and that of the functional Bcl-2 mRNA, i.e. the isoform 201 in the N390D/+ mice, as shown by RT-PCR analysis (Fig. 4d). The ratio of the Bcl-2 mRNA isoforms was quantitated using primer 1 and primer 3 in RT-PCR analysis. The data of Fig. 4 c and d strongly suggest that the increase of Bcl-2 mRNA 201 results from mis-regulation of Bcl-2 alternative pre-mRNA splicing in the spinal cord of N390D/+ male mice.

To investigate the possibility that the increase of TDP-43 (N390D) plays a causative role in altering the alternative splicing of Bcl-2 pre-mRNA towards the generation of higher level of Bcl-2-201 mRNA, we carried out DNA transfection analysis in mouse Neuro-2a (N2a) cell culture (Fig. 4e). As seen, under the condition of equal amounts of the endogenous TDP-43 vs. exogenously overexpressed mouse wild-type TDP-43, TDP-43 (A315T) and TDP-43 (N390D), respectively, i.e. increase of the total TDP-43 amount in N2a cells by 2 fold, similar to the range of increases (1.5–2.5 fold) of TDP-43 in the spinal cord of 3-month old and 12-month old N390D/+ male mice (Fig. 3b), the endogenous Bcl-2 mRNA 201 and Bcl-2 protein were elevated only in N2a cells expressing the exogenous TDP-43 (N390D) (Fig. 4e). Taken together, the data from Fig. 4b-e demonstrate that at comparably high levels, only mutant TDP-43 (N390D), but not wild-type or mutant TDP-43 (A315T), increases the expression of Bcl-2 mRNA isoform 201 as the result of changes in alternative splicing of the Bcl-2 pre-mRNA.

Besides Bcl-2, we also checked the expression patterns of several known TDP-43 target genes. Among them, the splicing pattern of the pre-mRNA of Eif4h was altered in mutant TDP-43 transgenic mouse models [1, 3, 65]. We found that the alternative splicing scheme of Eif4h pre-mRNA was also mis-regulated in the spinal cord of N390D/+ male mice at the age of 3 months (Additional file 7: Figure S7b) and at the symptomatic stage (data not shown). In addition, similar to changes observed in sporadic ALS patients [55], the mRNA levels of 3 genes, Ankrd12, Mapt, y Rbm39, were decreased in the spinal cord of 3-month old N390D/+ male mice (Additional file 7: Figure S7c) as well as 6-month old ones (data not shown).

TDP-43 proteinopathies and MN degeneration in culture

To examine whether the differential effects of TDP-43 (N390D and A315T) knock-ins on ALS pathogenesis were due, at least in part, to cell-autonomous effects on spinal cord motor neurons (MN), we generated spinal cord MN in culture. To accomplish this, the N390D/+ and A315T/+ mice were crossed with Hb9:GFP transgenic mice. Embryonic stem cells (ESCs) were derived from TDP-43 (A315T/+)/ Hb9:GFP or TDP-43 (N390D/+)/ Hb9:GFP mice, and then differentiated to GFP(+) MN in culture (Additional file 8: Figure S8). The survival curves as well as the average axonal lengths of the mutant MN were similar to those of (+/+) MN up to 7 days in culture (Fig. 5a-c) however, on day 14 in culture, the survival and average axon length of (N390D/+) MN was significantly reduced in comparison to (+/+) MN or (A315T/+) MN (Fig. 5a-c). Similar to (+/+) MN, the majority of TDP-43 of the mutant MN was confined in the nucleus prior to 7 days in culture, as shown by immunofluorescence staining (upper panels of Fig. 5b). However, the amount of TDP-43 was greater in the cytosol of (N390D/+) MN on day 14 in culture, but without TDP-43 aggregate formation, as shown in the lower panels of Fig. 5b. This observation was similar to that of the symptomatic spinal cord MN of N390D/+ male mice (Fig. 3c). On the other hand, the level of TDP-43 in ESC-derived mutant (A315T/+) MN was 2- to 4-fold higher than the (+/+) MN on day 7 and day 14, respectively. Interestingly, despite of the significant reduction of average axonal lengths of the mutant MN after day 14 in culture, the level of TDP-43 in mutant (N390D/+) MN was 6- and 11-fold higher than (+/+) MN on culture day 7 and day 14, respectively, with the appearance of TDP-35 species on day 14 in culture (Fig. 5d). The higher amount of TDP-43 in mutant MN could be in part due to increased stability of the mutant TDP-43 protein (Fig. 5e). Thus, the analysis of cultured MN derived from ESC suggests that time-dependent, spinal cord MN-autonomous toxic effects underlie the role of the N390D mutation of TDP-43 in age-dependent ALS-like pathogenesis of N390D/+ mice.

Comparative analysis of patho-signatures and neurodegeneration of cultured spinal cord MN derived from +/+ and mutant ESC. a Survival curves of MN in culture. The percentage(s) of GFP (+) cells in the cell mixtures on day 1 of MN culture is defined as 1. The data showed that (N390D/+) MN became more vulnerable to death than (A315T/+) MN or (+/+) MN on day 14 in culture. Mean ± SD *pag < 0.05. B Immunofluorescence co-staining analysis of MN on day 7 and day 14 in culture using anti-ChAT (green or red) and anti-TDP-43 (red or white). The white boxes in the panels of the first column mark the areas magnified for higher resolution. The axonal morphology under lower magnified field is displayed with Z-axis projection. The scale bars are 50 μm. C The statistical analysis of the axon lengths from the WT and mutant MN on different days in culture is shown in the line graph. norte > 50. *pag < 0.05. D Comparison of the levels of TDP-43 at early stages of ESC-derived MN in culture (from day 1 to day 3), as analyzed by Western blotting. The statistical analysis is shown in the lower scatter plot (mean ± SD). * pag < 0.05. mi The stability of TDP-43 polypeptides in spinal cord (N390D/+) MN, (A315T/+) MN, and (+/+) MN on day 2 in culture by cycloheximide (CHX) assay and Western blotting analysis. The graph below the blots shows that TDP-43 is more stable in (N390D/+) MN in comparison to either (+/+) MN or to (A315T/+) MN. *pag & lt 0.05

Increase of Bcl-2 mRNA and Bcl-2 protein in cultured (N390D/+) MN

Significantly, in parallel to the time-dependent increase of the TDP-43 level (Fig. 6a), there was an increase of either Bcl-2 mRNA 201 or Bcl-2 protein in the cultured (N390D/+) MN (Fig. 6b and c) resulting from mis-regulation of the alternative splicing of Bcl-2 pre-mRNA (Fig. 6d). On the other hand, the levels of Bcl-2 mRNA 201 and Bcl-2 protein in (A315T/+) MN were similar compared to those of (+/+) MN on culture after day 2 (Fig. 6b) and day 14 (data not shown), despite of the increase of TDP-43 in cultured (A315T/+) MN (Fig. 6a). The data of Figs. 4 and 6 together indicate that there are cell-autonomous mis-regulation of Bcl-2 pre-mRNA splicing and consequent increase of Bcl-2 protein in (N390D/+) MN as caused by the increased level of TDP-43. Furthermore, there is a lag between the time on-set of Bcl-2 protein increase and MN degeneration.

Mis-regulation of Bcl-2 expression and calcium ion homeostasis in cultured (N390D/+) MN. a Comparison of the levels of TDP-43 at early stages of ESC-derived MN in culture (from day 1 to day 3), as analyzed by Western blotting. The statistical analysis is shown in the lower scatter plot (mean ± SD). B Comparison of the expression levels of Bcl-2-201mRNA and Bcl-2 protein as analyzed by RT-PCR (exemplified in the upper panels) and Western blotting (exemplified in the middle panels), respectively. The statistical analysis is shown in the lower scatter plots (mean ± SD). C Comparison of the levels of Bcl-2 mRNA by RT-PCR (upper panel) and Bcl-2 protein by Western blotting (lower panel) and in cultured (+/+) MN and (N390D/+) MN on day 2 and day 14, respectively. D RT-PCR detection and statistical analysis (left scatter plot, mean ± SD) of the changes of the relative ratio of the two Bcl-2 mRNA isoforms. Note the increase of functional Bcl-2 -201 mRNA in the spinal cord of N390D/+ male mice at both pre-symptomatic (3-month) and symptomatic (6-month) stages. norte = 3 (randomly chosen from each of the two independent lines) per group. mi The relative levels of the cytosolic calcium ion levels in cultured MN (left plot) and transfected HEK-293 T cells (right plot) overexpressing human TDP-43(wild-type WT), TDP-43 (A315T) or TDP-43 (N390D). The relative calcium ion levels were analyzed with the use of Fura2-AM reagent and compared in the separated scatter plots (mean ± SD). Note the overloading of the cytosolic calcium ion in cultured (N390D/+) MN and in HEK-293 T cells overexpressing TDP-43 (N390D) in comparison to TDP-43 (WT) and TDP-43 (A315T). Significantly different represented in a-mi: * pag & lt 0.05, ** pag < 0.01, # pag < 0.001. n.s., not significant

Changes of calcium ion homeostasis in cultured (N390D/+) MN

Since Bcl-2 is known to increase ER calcium ion leakage resulting in overloading of the cytosolic calcium ion (Ca 2+ ) [7, 46], we examined the intracellular level of calcium ion in ESC and ESC-derived spinal MN. As seen, the cytosolic calcium ion concentrations in the (N390D/+) ESC-derived MN was higher than those derived from (+/+) ESC or (A315T/+) ESC (Fig. 6e, left panel), despite similar concentration of calcium ion in (+/+) ESC, (A315T/+) ESC and (N390D/+) ESC (data not shown). Furthermore, overexpression of human TDP-43 (N390D) provoked the intracellular level of calcium ion in HEK293T cells, but not in those cells overexpressing similar amount of either wild-type TDP-43 or TDP-43 (A315T) (Fig. 6e, right panel). A previous study [43] also provided relevant evidence that Bcl-2 was involved in neurotoxicity. In particular, knockdown of Bcl-2 by siRNA in stable clones of HEK-293 cells expressing mutant TDP-43 (A382T) or TDP-43 (M337 V) would decrease the mislocalizaiton of TDP-43 and reduce Ca 2+ release from ER. Thus, neurotoxicity indeed could be caused by up-regulation of Bcl-2 protein. The above data taken together show that elevation of the cellular level of TDP-43 (N390D) would increase the intracellular cytosolic calcium ion concentration as a result of the increase of Bcl-2 protein.


Symptoms in ALS Mouse Model Improve with CRISPR Base Editing

Abby Olena
10 de abril de 2020

ABOVE: Astrocytes (blue) have infiltrated the interior of the spinal cord, affecting neurons (yellow) in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the study, the researchers developed an approach to deliver a CRISPR base editing system (green) to astrocytes in order to disable the expression of a mutant gene and reduce symptoms.
COLIN LIM, UNIVERSITY OF ILLINOIS

B ase editors, which convert one nucleotide to another without a double-strand DNA break, have the potential to treat diseases caused by mutant genes. One drawback, though, is that the DNA that encodes CRISPR base editors is long—too long to fit in the adeno-associated viruses (AAVs) most commonly used for gene therapy. In a study published in Molecular Therapy on January 13, researchers split the DNA encoding a base editor into two AAV vectors and injected them into a mouse model of inherited amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The strategy disabled the disease-causing gene, improving the animals’ symptoms and prolonging their lives.

“We’d like to be able to make gene editing tools that can fit inside an AAV vector. Unfortunately, some of the tools are so big that they can’t fit inside, so in this study, they were able to come up with a solution to that by using a split protein,” says David Segal, a biochemist at the University of California, Davis, who was not involved in the work. “It’s not the first time that that system has been used, but it’s the first time it’s been applied to this kind of base editor.”

Pablo Perez-Pinera, a bioengineer at University of Illinois at Urbana-Champaign, and colleagues developed a strategy to split the base editor into two chunks. In a study published in 2019, they generated two different AAV vectors, each containing a portion of coding DNA for an adenine-to-thymine base editor. They also included sequences encoding so-called inteins—short peptides that when they are expressed within proteins stick together and cleave themselves out, a bit like introns in RNA. The researchers built the inteins into the vectors such that when the inteins produced by the two vectors dimerized, bringing the two base editor parts together, and then excised themselves, they left behind a full-length, functional base editor.

When Perez-Pinera told Thomas Gaj, also a bioengineer at the University of Illinois at Urbana-Champaign, about the strategy, Gaj tells The Scientist, they immediately set out to test it in a mouse model of ALS. The transgenic mice have about 25 copies of the human gene, superoxide dismutase 1 (SOD1), with mutations that cause ALS in people. The animals display motor neuron loss and muscle atrophy, plus their neurons accumulate inclusions—dense spots in the gray and white matter of their spinal cords that include SOD1 protein—before dying at about four months of age on average. The symptoms and life expectancy in the 20 percent of ALS patients with mutations in SOD1 vary based on which mutation they have, but most have muscle weakness and motor neuron death, as well as inclusions containing SOD1 protein.

Instead of using the adenine-to-thymine base editor, the researchers developed a cytosine-to-thymine converter using the coding sequence of Streptococcus pyogenes Cas9 and a guide RNA that targets both wild type and mutant human SOD1 to create an early stop codon. This doesn’t affect the mouse SOD1. In human cells, the split base editor seemed to be even more efficient than when the editor was transfected at full length, hitting about 29 percent of the target sites, compared to the full-length editor’s 19 percent.

Next the authors packaged their split base editor into two AAV backbones and injected them or a control AAV into the animals’ lumbar cerebrospinal fluid when they were around two months old. The vectors ended up primarily in astrocytes, as well as in neurons and microglia. While the researchers didn’t see a difference in symptom onset at around three months, the mice that received the base editor maintained their weight and lived about 10 percent longer than controls. The treated mice also had fewer SOD1-positive inclusions and healthier motor neurons.

“Using base editors to disable the mutant SOD1 gene in astrocytes (a cell type that normally supports healthy nervous system function but in SOD1-ALS exerts toxicity onto motor neurons) led to a marked slowing in disease progression,” Gaj writes in an email to The Scientist. “Since many persons with ALS are diagnosed following the onset of symptoms, pre-clinical strategies that can meaningfully slow the disease are especially important and should be further studied.”

“This is a good indication that base editing actually can be used to treat ALS,” says Baisong Lu, a gene therapy researcher at Wake Forest School of Medicine who did not participate in the work. He cautions that off-target effects—the base editor can edit both DNA and RNA—and how long the AAV delivery method lasts are both in need of more work before this technique would be safe for people.

The dual AAV strategy could also be expensive, says Mimoun Azzouz, a neuroscientist at the University of Sheffield in the United Kingdom. “Thinking about the clinical development and marketing and the commercialization of this product, you need to manufacture two viruses, and you need to assess these two viruses for safety, so the cost can be extremely high.”

Despite the challenges, the strategy shows promise for translation to humans, Perez-Pinera writes in an email to The Scientist. AAVs are already approved by the Food and Drug Administration for gene therapy, he explains. Plus, using a humanized model of the disease—a mouse that contains the human sequence of the target gene—means that the method validated in mouse models can be translated to people without adapting them to target a different sequence. People who develop ALS due to a mutation in SOD1 also have one good copy of the gene, just like the mice, which have a functioning mouse copy.

“We injected animal models shortly before disease onset. While injecting the animals earlier could improve the outcome of the disease as demonstrated in other studies, the reality is that ALS is not typically diagnosed until the patient experiences symptoms. Our study predicts what can be expected from treating a patient recently diagnosed with the disease,” Perez-Pinera writes.

“We still have some distance to travel before the results in our current study can benefit ALS patients,” Gaj acknowledges. The researchers are working on minimizing off target effects and on developing new delivery methods that could improve efficacy. “We still have a number of important questions to answer and technological hurdles to address before we begin thinking about clinical translation.”

C.K.W. Lim et al., “Treatment of a mouse model of ALS by en vivo base editing,” Molecular Therapy, doi:10.1016/ j.ymthe.2020.01.005, 2020.

Abby Olena is a freelance journalist based in Alabama. Find her on Twitter @abbyolena.


Why to use transgenic mice in ALS models? - biología

Mouse Models

The generation of genetically modified mice may be divided into two main categories: targeted integration (insertion or deletion) and random integration of DNA into the mouse genome. In the first category, gene targeting is typically performed in embryonic stems (ES) cells and is ideally suited to deletion (or modification) of endogenous alleles. The MBP also uses newer genome editing technologies (e.g., CRISPR/Cas) to create knockout and knockin mice at lower cost and in significantly less time than conventional, homologous recombination-based approaches in ES cells. In the second category, pronuclear injection generates transgenic mice by random integration of DNA (e.g., LacZ, GFP, etc) into the mouse genome.

Your specific scientific hypothesis-driven question will drive which approach to use to create the most appropriate mutant mouse model for research.

Comparison of ES cell Targeted, Transgenic and CRISPR gene modification systems

Site specific integration, no unintended disruption of endogenous gene function.

Increased time to generate founders due to cell culture and germline transmission from chimeras.

Lower overall project cost compared to ES cell based targeting.

Unpredictable insertions sites. Endogenous gene disruption that may lead to confounding phenotypes.

Lower overall project cost compared to ES cell based targeting.

Low flexibility in model design and transgene insertion size.

Single copy insertion of gene construct, rarely undergoes gene silencing.

Higher overall project cost of compared to random transgenics and CRISPR.

Rapid generation of founders.

Multiple insertion sites and/or copy number leading to diminishing expression or silencing.

Shorter project timeframe. In general, KO creation using CRISPR/Cas9 can create an InDel in 1/3 the time of traditional ES cell targeting

Off target effects need to be identified and bred out in subsequent generations

Stable integration and germline transmission.

Limited to genetic background of available, germline competent, ES cells.

Not limited by genetic background

Multiple independent founders may be necessary to identify the desired expression pattern.

Not limited by genetic background. The MBP has high success using the CRISPR/Cas9 platform in C57BL/6 genetic backgrounds


Top 5 Benefits of Transgenic Animals | Biotecnología

The following points highlight the top five benefits of transgenic animals. The benefits are: 1. Normal Physiology and Development 2. Study of Disease 3. Biological Products 4. Vaccine Safety 5. Chemical Safety Testing.

Benefit # 1. Normal Physiology and Development:

Transgenic animals can be specifically designed to allow the study of how genes are regulated and how they affect the normal functioning of the body and its development.

For example, the study of complex factors involved in growth such as insulin likes growth factors.

Benefit # 2. Study of Disease:

Many transgenic animals are designed to increase the understanding of that how genes contribute to the development of diseases such as cancer, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis and Alzheimer.

These are specially made to serve as models for human diseases, so that investigation of new treatments for diseases is made possible.

Benefit # 3. Biological Products:

Human disease can be treated by medicines that contain biological products.

(a) Transgenic animals that produce useful biological products can be created by the introduction of the portion of the DNA or genes that codes for a particular product such as human protein (alpha-1-antitrypsin) which is used to treat emphysema.

(b) Similar attempts are being made for the treatment of phenylketonuria (PKU) and cystic fibrosis. For example, the first transgenic cow Rosie produced human protein enriched milk (2.4 g/L) in 1997. The milk contained the human alpha lactalbumin and was nutritionally a more balanced product for human babies than natural cow milk.

Benefit # 4. Vaccine Safety:

Transgenic mice are being used in testing the safety of vaccines before they are used in humans, e.g., polio vaccine.

These animals are also used for the toxicity or safety testing procedures. If found reliable and successful they could replace the use of monkeys in order to test the safety of batches of the vaccine.

Benefit # 5. Chemical Safety Testing:

Transgenic animals are made to carry the genes, which make them more sensitive to the toxic substances than the non-transgenic ones. They are then exposed to toxic substances and effects are studied. This is known as toxicity/safety testing.


Applications of Transgenic Technology

Transgenic animals, primarily mice, used thus far almost exclusively for basic research, have revolutionized our knowledge of mammalian developmental genetics. However, this technology also has significant potential for genetic engineering of livestock. The many uses of transgenic mice for basic studies have been reviewed previously ( Gordon 1989 ). In the present paper, the use of gene insertion to elucidate mechanisms of gene regulation will be briefly reviewed, after which an example from our laboratory of a transgenic model of the human neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis will be described. Models of hepatitis B infection and ankylosing spondylitis will also be presented. These examples are discussed not only because they illustrate the power of this experimental paradigm, but because they highlight some of the ways in which transgenic experimentation can have an impact on laboratory animal management.

Transgenic Mice and Gene Regulation

Perhaps the most important contribution of transgenic technology to biomedical science has been its use for determining the mechanisms by which genes become differentially regulated during mammalian development. Since all cells of the developing mammal are clonal descendants of the fertilized egg, and since all contain the same genetic information, it is critical to understand how, during the process of differentiation, tissue-specific genes are activated while most others are permanently silenced. The ability to introduce new genes into random sites in the genome provided an important tool for solving this puzzle.

One of the early publications involving transgenic mice provided an important piece to that puzzle: Brinster and others (1981 ) linked the gene encoding Herpes virus thymidine kinase (TK) to several hundred bases of DNA that immediately flanked the mouse metallothionein-1 (MT-l) gene, and that contained the gene promoter. The MT-I gene, though ubiquitously expressed, is most active in liver, and is inducible by heavy metal exposure. When the MT- 1/TK construct was introduced into mice, transgenic animals expressed TK in a pattern typical of MT- 1, and the gene could be activated further by exposing the animals to cadmium. This study demonstrated that cis-acting elements in or around genes carry information that dictate tissue-specificity of expression. As noted earlier in the discussion of globin gene expression, these cis-acting elements are subject to effects of chromosomal position if they are incomplete. While some genes carry multiple elements (such as globins), others appear more simply regulated (MTs). Genes expressed in multiple different tissues contain many different elements, with some devoted to expression in each tissue ( Gordon and others 1987 ). When genes are transferred across species barriers, evolutionary changes in organ-specific gene regulation can lead to aberrant patterns of transgene expression. For example, the human fetal globin gene, normally active in the human fetal liver, is expressed in the embryonic yolk sac in transgenic mice. This is because the mouse uses its own fetal gene for production of globin in the embryonic hematopoietic compartment ( Chada and others 1986 ). Details of these regulatory phenomena are reviewed extensively elsewhere ( Gordon 1989 ).

A Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis

One of the most important uses of transgenic animals is for modeling human diseases or disease processes. Among the major successes in this area has been the production of a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also called Lou Gehrigs disease. ALS is an age-related neurodegenerative disorder that primarily involves motor neurons. Although the majority of ALS cases are sporadic, a subset of affected individuals inherit the disease. Rosen and others (1993 ) observed that a subset of individuals with familial, autosomal dominantly inherited ALS (FALS) harbor mutations of the Cu/Zn superoxide dismutase (SOD-l) gene. These findings indicate a causative relationship between altered SOD-1 activity and motoneuron degeneration. Because humans with ALS are generally not identified until muscle weakness sets in, early medical intervention and prevention is difficult. For these reasons it is highly desirable to develop an animal model of FALS. To this end, we introduced a mutation into the 4th exon of a 15 kb mouse genomic clone that we had previously isolated ( Benedetto and others 1991 ) such that a glycine residue (GGC) at position 86 of the protein was changed to an arginine residue (CGC). This same mutation is found in some families with FALS ( Rosen and others 1993 ). The sequence change not only creates a mouse counterpart of a pathogenic human gene sequence, it introduces a recognition sequence for FspI restriction endonuclease. The new restriction enzyme site allowed us to distinguish the transgene DNA and RNA from those of the endogenous mouse genes. This construct was then microinjected to produce transgenic mice ( Ripps and others 1995 ).

In 2 mouse lines that produced high levels of transgene mRNA in the central nervous system (CNS), motor paralysis developed. This phenotype was associated histopathotogically with degenerative changes of motoneurons within the spinal cord, brain stem, and neocortex ( Ripps and others 1995 ). These animals constitute a potentially valuable animal model of ALS. In humans with FALS, who harbor mutations at the SOD-1 locus, many genetic and environmental variables complicate analysis of the relationship between the mutations found and the appearance of this disease. The transgenic mice produced are of the highly inbred FVB/N strain and are housed under uniform conditions. As a consequence, appearance and progression of symptoms is very consistent between animals, such that all mice die between the ages of 94 and 117 days. This consistency allows for sensitive testing of potential therapeutic agents or environmental factors that might alleviate or exacerbate the disease, because a change in lifespan of only a few days would be statistically significant. Moreover, because the genetic basis for the disease can be known immediately after birth, early manifestations of the disorder can be studied in detail, and therapeutic interventions can be attempted at all stages of disease progression. Similar findings have been reported by a group that introduced a mutated human gene into the mouse germ line ( Gurney and others 1994 ).

Important features of these abnormal animals from the point of view of laboratory animal management is early onset and rapid progression of the paralysis, as well as reduced breeding efficiency. Females breed very poorly, and males die at 94-117 days of age. These characteristics require that the transgene be transmitted through males in the few weeks between the onset of reproductive maturity and death from motor paralysis, in order to assure survival of the line, we place a male with several females. When a female delivers pups, she remains in the cage for at least one additional day to assure that she mates again. Only then is the female and litter separated from the other adults in the group. These kinds of breeding practices are unusual, but often necessary, and tolerance of them by veterinary personnel and others should be encouraged.

Transgenic Models of Hepatitis B Infection

Chronic hepatitis B (HBV) infection is one of the most common gastrointestinal diseases in the world, and can have serious sequelae: Chronic active hepatitis, which is associated with ongoing liver cell injury, dramatically increases the risk of developing hepatocellular carcinoma (HCC). However, the mechanism by which chronic hepatitis B infection predisposes to development of HCC remains unclear. The chronic inflammatory process, accompanied by liver cell death and regeneration, may ultimately lead to transforming mutations in hepatocytes. Alternatively integration of viral DNA, a common event in HCC cells, may disturb host cell gene regulation and lead to malignant degeneration.

Because of the narrow host range of this virus, there are very few useful animal models of HBV infection. However, transgenic technology affords the opportunity to produce mouse models of the condition. Moreover, because transgenic technology inevitably involves integration of the donor DNA, this particular characteristic of HBV DNA in HCC can readily be achieved in transgenic mice.

Initial efforts to produce HBV transgenic mice focused on the surface antigen gene (HBsAg), the prevalent circulating antigen in chronic persistent hepatitis. When this gene was linked to the MT-I promoter ( Chisari and others 1985 ), introduced under control of its own promoter ( Babinet and others 1985 ), or, if the entire HBV genome was introduced ( Farza and others 1988 Araki and others 1989 ), production of HBsAg and antigenemia could be documented. Mice expressing surface antigen were found to be more sensitive to chemical carcinogenesis in the liver ( Dragani and others 1989 Sell and others 1991 ), findings that suggest that environmental factors may play an important role in the transition from chronic infection only to HCC.

When Chisari and others (1989 ) linked the large envelop polypeptide region, which contains the HBsAg gene, to the strong albumin promoter/enhancer region, transgenic mice expressed large quantities of HBsAg and eventually developed HCC ( Chisari and others 1989 Dunsford and others 1990 ). These findings support the hypothesis that chronic liver cell injury plays an important role in HBV-induced HCC ( Dunsford and others 1990 ).

Another HBV gene implicated in HCC is HBx gene, which encodes a transcriptional trans activator. Kim and others (1991 ) introduced this gene under the control of its own promoter into mice, and observed high expression of HBx in liver, kidney, and testis. By 4 months of age focal areas of hepatocyte abnormalities were present, and definite tumors diagnosed as clear cell carcinomas were manifest by 8 to 10 months. Carcinomas, some with metastases, killed the animals by 11 to 15 months of age.

In summary, the species barrier to HBV infection can be overcome in mice by direct microinjection of HBV genes. The genes integrate, and when HBsAg is expressed at high levels, liver cell injury and HCC develop. The HBx gene alone, when expressed at high levels, also can cause liver cancer. It is unclear whether any of these HBV transgenic mice develop liver cancer by the same mechanism as humans.

To what extent do transgenic mice carrying the genes of a dangerous human pathogen such as HBV pose a threat of zoonotic transmission of disease? Of all HBV transgenic mice, only those that carry the entire HBV genome have the potential to produce an infectious HBV particle. Although HBV cannot infect mouse cells, it is possible that an animal with the entire genome in every cell could produce mature virions and release them into its serum. In fact, some transgenic mice that carry the entire HBV genome carry core antigens in blood ( Araki and others 1989 ). While viral titers are extremely low, it must be acknowledged that in cases such as this, the risk of zoonoses may be significant.

To date, transmission of disease specific to expression of a transgene from a transgenic animal to man has not been reported. However, it is important to study new proposals involving insertion of human pathogens to determine if risk exists.

Transgenic Rats with Ankylosing Spondylitis

In humans, the HLA-B27 haplotype is associated with inflammatory disease involving the skin, gastrointestinal tract, genitourinary tract, eye, and heart. The disorder with the strongest link to HLA-B27 is ankylosing spondylitis, an inflammatory disorder that most often causes inflammation of the spine or sacroiliac joints, or both. A possible causative role for the HLA-B27 haplotype and development of the disease was not established until Hammer and others (1990 ) produced transgenic rats carrying human HLA-B27 determinants. In this experiment the HLAB27 genes were co-injected with the gene encoding human β 2 -microglobulin, which is required for MHC antigen presentation. Transgenic rats expressing high levels of HLA-B27 on the cell surface in association with β 2 -microglobulin developed a variety of inflammatory disorders that strongly resembled human HLA-B27-related disease, including gastrointestinal, skin, genitourinary joint, and cardiac involvement. These animals thus establish a model system for studying many of the perplexing aspects of these disorders, including the fact that many of the pathological sequelae are precipitated by an episode of infection.

This model is mentioned here not only because it constitutes a major breakthrough in the understanding of these inflammatory diseases, but because it illustrates that different species can respond differently to transgene expression. In prior experiments where HLA-B27 genes were expressed in transgenic mice, no pathology resulted ( Hammer and others 1990 ), while the transgenic rats exhibited profound phenotypic changes. This observation is relevant to the evaluation by animal care committees of proposed transgenic experiments. Selection of species for gene insertion can be critical to an experiment and thus, the proposal to insert genes into species other than mice should not be regarded as excessive or unnecessary without prior thorough analysis.


Abbreviations used: GFP, green fluorescent protein PE, phosphatidylethanolamine ES cells, embryonic stem cells FCS, fetal calf serum PFA, paraformaldehyde PB, phosphate buffer EDL, extensor digitorum longus ER, endoplasmic reticulum MHC, major histocompatibility complex DIC, differential interference contrast.

Article published online ahead of print. Mol. Biol. Cell 10.1091/mbc.E03–09–0704. Article and publication date are available at www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E03-09-0704.