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Entrega in vivo de ssDNA

Entrega in vivo de ssDNA


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Estoy buscando un sistema con el que pueda entregar (grandes cantidades de) ssDNA en vivo (digamos en ratones). No sé si es importante, pero se supone que el extremo 5 'de los fragmentos de ssDNA está fosforilado.

Si pudiera sugerirme algunos sistemas de entrega eficientes, estaría encantado.

¡Muchas gracias por su ayuda de antemano!


En vivo Comparación de la administración local versus sistémica de ARNip inmunoestimulante en tumores provocados por el VPH

Se ha demostrado que los ARN de interferencia pequeños (ARNip) para inhibir la expresión de oncogén y también para activar respuestas inmunitarias innatas a través del reconocimiento del receptor tipo Toll (TLR) son beneficiosos como terapia contra el cáncer en ciertos modelos de cáncer. En este estudio, investigamos los efectos de la administración local versus sistémica de tales ARNip de sustrato de Dicer inmunoestimulantes (IS-DsiRNA) en un modelo de tumor impulsado por el virus del papiloma humano (VPH). La administración de ARNip localizada usando inyección intratumoral de ARNip fue capaz de aumentar la administración de ARNip al tumor en comparación con la administración intravenosa (IV) y las respuestas inmunitarias innatas activadas de forma potente. Sin embargo, la inyección intravenosa siguió siendo la vía de administración más eficaz para reducir el crecimiento tumoral. Aunque los IS-DsiRNA activaron las células inmunes innatas y requirieron interferón-α (IFNα) para un efecto completo sobre el crecimiento tumoral, encontramos que un potente silenciador de ARNip que actuaba independientemente del IFNα era en general más efectivo para inhibir el crecimiento tumoral TC-1. Otros trabajos publicados que utilizan IS-siRNA se han llevado a cabo en modelos tumorales con bajos niveles de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) -clase 1, un objetivo de las células asesinas naturales que son activadas de forma potente por IS-siRNA. Como las células TC-1 utilizadas en nuestro estudio expresan altos niveles de MHC de clase I, la adición de los motivos inmunoestimuladores puede no ser tan beneficiosa en este modelo de tumor en particular. Nuestros datos sugieren que la selección del perfil de ARNip y el método de entrega basado en el entorno tumoral es crucial para desarrollar terapias basadas en ARNip.

Tenga en cuenta: El editor no es responsable del contenido o la funcionalidad de la información de apoyo proporcionada por los autores. Cualquier consulta (que no sea el contenido faltante) debe dirigirse al autor correspondiente del artículo.


Entrega liposomal de ácidos nucleicos En vivo

La optimización de complejos liposomales catiónicos para aplicaciones in vivo y terapéuticas es compleja que involucra muchos componentes distintos. Estos componentes incluyen purificación de ácidos nucleicos, diseño de plásmidos, formulación del vehículo de administración, ruta y programa de administración, dosificación, detección de expresión génica y otros. Esta revisión se centrará en la optimización de estos componentes para su uso en una variedad de en vivo aplicaciones. Uso de formulaciones de liposomas mejoradas para la administración. en vivo es valioso para la terapia génica y evitaría varios problemas asociados con la liberación viral. La administración de ácidos nucleicos usando liposomas es prometedora como un enfoque seguro y no inmunogénico para la terapia génica. Además, las terapias génicas compuestas de reactivos artificiales pueden estandarizarse y regularse como fármacos en lugar de biológicos. La optimización de todos los componentes del sistema de administración permitirá un amplio uso de complejos liposomales para tratar o curar enfermedades o trastornos humanos.


MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas celulares y reactivos

La línea celular de cáncer colorrectal humano HCT116 se obtuvo de la Colección de cultivos tipo de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) y se cultivó en RPMI1640 que contenía suero bovino fatal (FBS, 10%) y penicilina-estreptomicina (100 UI / ml). La línea celular de cáncer colorrectal humano CL187 se obtuvo de ATCC y se cultivó en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía FBS (10%) y penicilina-estreptomicina (100 UI / ml). Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de CO2 atmósfera.

Se utilizaron dos tampones: tampón de lavado (WB, 4,5 g / L de glucosa y 5 mM de MgCl2 en PBS) y tampón de unión (BB, 1 mg / ml de albúmina de suero bovino y 0,1 mg / ml de ADN de esperma de salmón en WB).

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de China (Shenyang, China) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los voluntarios que proporcionaron muestras de sangre para este estudio.

Síntesis de ADN

El aptámero L33 (5′-ACCTAACTTCGTCGAGAGTTTTTCGTCTCGGCTAGT GTGATAGTGTTAGG-3 ′) y la biblioteca de ssDNA (5′-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-45N-TTAGGGTGTGTCGTCGCTAGT GTGATAGTGTTAGG-3 ′) fueron sintetizados por Biotechnology Co. Para los ensayos de unión, el aptámero sintético o la biblioteca de ssDNA se marcó con FITC en el extremo 5 '.

Internalización celular de aptámero L33

Se cultivaron células HCT116 y CL187 en portaobjetos de cámara y se cultivaron durante la noche. Las células se lavaron con WB y se incubaron con L33 marcado con FITC o una biblioteca de ssDNA a una concentración final de 250 nM durante 2 horas a 4 ° C o 37 ° C, respectivamente. Después de lavar dos veces, las células se fijaron con formaldehído al 4% durante 15 min y se contratiñeron con DAPI durante 5 min. Finalmente, las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (Olympus IX51, Japón).

Para el análisis de citometría de flujo, las células se digirieron con EDTA al 0,1% / PBS y se incubaron con L33 marcado con FITC a 37ºC durante 2 horas antes de la incubación con tripsina al 0,025% durante 10 minutos. Posteriormente, las células se lavaron con WB tres veces y se suspendieron en 300 µl de PBS. Finalmente, la intensidad de la fluorescencia se determinó mediante citometría de flujo (BD, EE. UU.).

Ensayo de bioestabilidad de Aptamer L33

Para verificar la estabilidad biológica de la en vivo aplicaciones de aptámero L33, llevamos a cabo un experimento de estabilidad de plasma aptámero. Se preparó plasma humano fresco mediante centrifugación de sangre completa. Se mezcló L33 (0,8 nmol) con medio que contenía FBS al 10% o plasma humano y se incubó a 37ºC durante 6 h. A continuación, la mezcla se recogió en diferentes momentos (0, 0,5, 1, 2, 3, 4 y 6 h) y se separó electroforéticamente en geles de agarosa al 3% y se fotografió. Para el análisis de citometría de flujo, después de la incubación en medio o plasma humano durante 6 horas, se añadió L33 marcado con FITC a células HCT116 a 4ºC durante 20 minutos y se determinó. Se usó una biblioteca de ssDNA marcada con FITC como control negativo.

Complejo L33-Dox

Se incubaron diferentes concentraciones de aptámero L33 con Dox (Sigma) 3 µM en PBS a temperatura ambiente durante 60 minutos a relaciones molares de aptámero / Dox de 0, 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 2. La fluorescencia Luego se examinó el espectro de Dox usando un espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-4500 (λEx = 488 nm, λEm = 520-680 nm).

Afinidad y especificidad del complejo L33-Dox

Para evaluar la unión específica del complejo L33-Dox a las células HCT116 diana, se realizó un ensayo de competición. Las células HCT116 se incubaron primero con el complejo L33-Dox a 4 ° C durante 20 min, luego se lavaron dos veces y se suspendieron en L33 marcado con FITC durante 20 min adicionales de incubación. Finalmente, la intensidad de la fluorescencia se determinó mediante citometría de flujo. La afinidad de unión del complejo L33-Dox se determinó incubando células HCT116 a 4 ° C durante 20 min con concentraciones seriadas (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 y 256 nM) de FITC. complejo L33-Dox marcado. Las constantes de disociación de equilibrio (KD) del complejo se obtuvieron luego usando el software Sigma Plot (Jandel, San Rafael, CA). Los experimentos del ensayo de unión se repitieron al menos tres veces y la biblioteca de ssDNA marcada con FITC se utilizó como control negativo.

Estudios de captación celular del complejo L33-Dox

La captación celular específica del complejo L33-Dox por las células diana se estudió mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Se permitió que las células HCT116 o CL187 se adhirieran a placas de 24 pocillos durante la noche y luego se incubaron con 2,0 µM de Dox libre o complejo L33-Dox en medio de cultivo durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar dos veces, las células se fijaron con formaldehído al 4% durante 15 min y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Para el análisis de citometría de flujo, las células se digirieron con EDTA al 0,1% / PBS y se incubaron con Dox libre 2,0 µM o complejo L33-Dox durante 2 horas a 37ºC. Después de dos lavados, las células se determinaron mediante citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad del complejo L33-Dox

Las citotoxicidades del complejo Dox libre y L33-Dox para cada línea celular se determinaron usando ensayos MTS (Promega, EE. UU.). Las células cultivadas en placas de 96 pocillos se trataron con Dox libre o complejo L33-Dox en medio. Después de la incubación durante 4 horas, las células se lavaron tres veces con PBS y se añadió medio fresco para el crecimiento celular adicional durante 48 horas. A continuación, se añadió reactivo CellTiter (20 µl) a cada pocillo y las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora. La absorbancia (490 nm) se registró usando un lector de placas.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como las medias ± DE, y las evaluaciones estadísticas se realizaron con Student's de dos colas no apareados. t pruebas. PAG los valores por debajo de 0,05 se consideraron significativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.


Acelere sus proyectos de cribado CRISPR

Las roturas bicatenarias se generan a través de la edición CRISPR / Cas9, y luego se reparan mediante las vías celulares endógenas de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y HDR. Si bien la vía HDR ha demostrado ser exitosa en la copia de información genética mediante recombinación homóloga, la inserción de material genético exógeno es un desafío debido a las ineficiencias inherentes de HDR. El ADN de doble hebra ha sido históricamente la plantilla elegida para las inserciones de genes, pero investigaciones recientes han demostrado la superioridad de los ssODN como plantilla donante para HDR. Ofreciendo una eficiencia mucho mayor para insertar secuencias largas con brazos de homología más cortos, el ssDNA se ha convertido en la plantilla donante preferida para este proceso. GENEWIZ ahora ofrece fragmentos de ssDNA largos (hasta 10,000 nt), lo que permite la inserción de secuencias largas con alta eficiencia y toxicidad celular reducida o integración fuera del objetivo en comparación con los donantes de dsDNA.

Figura 1.1. El ARN guía forma un complejo con la enzima que dirige Cas9 para escindir el ADN diana, lo que da como resultado una ruptura de doble hebra (DSB).

Figura 1.2. La reparación dirigida por homología después de DSB en presencia de una plantilla de donante de ssDNA da como resultado un gen knock-in preciso.


Conclusión y perspectivas: ¿cuál será el futuro de la transgénesis en ratones?

La tecnología de edición de genes CRISPR / Cas9 ha cambiado considerablemente las tecnologías de transgénesis. En los últimos 3 a 5 años, se han observado logros notables a un ritmo rápido. Las técnicas Easi-CRISPR e i-GONAD tienen el potencial de remodelar por completo la ruta tradicional de generar alelos modificados en ratones si las técnicas son ampliamente adoptadas por muchos grupos de investigación e instalaciones centrales de transgénesis. Es predecible que pronto se omitirán todos los pasos convencionales para generar eficientemente alelos knockout o knockin en ratones y los reactivos CRISPR / Cas9 se administrarán in situ en el oviducto. Requerirá personal menos capacitado o equipo especializado, ya que un microscopio estereoscópico y un dispositivo de electroporación serían suficientes para generar la edición de alelos simples o complejos. Es importante destacar que permitirá la reducción del uso de animales en línea con la regla de las 3R para el trabajo con animales. Yo predeciría que el reciente desarrollo tecnológico en la edición de genes y la reproducción asistida redefinirá décadas de transgénesis. El futuro dirá cuál será el ritmo de estos cambios.


Discusión

los Agrobacterium El mecanismo de patogénesis permite la transferencia eficiente de moléculas de ssDNA largas a células eucariotas [2]. La proteína VirE2 está involucrada en este proceso protegiendo el ssDNA de la degradación de nucleasas y mediando la importación nuclear [2]. Aquí, con base en nuevos hallazgos experimentales, proponemos que VirE2 es un efector que se transporta al citoplasma del hospedador en una etapa temprana para atraer activamente el ADN-T al hospedador y protegerlo de la degradación de nucleasas desde el primer momento en que ingresa al celda. En un primer paso, una sola proteína VirE2 se une al ADN-T cuando ingresa a la célula vegetal. Esta unión, que se produce en un movimiento similar a una cremallera, está principalmente limitada por las fluctuaciones térmicas del T-DNA. En un segundo paso, la unión cooperativa rápida de VirE2 facilita la formación de una estructura helicoidal y atrae activamente el T-DNA hacia el citosol de la planta (Figura 5). Este modelo tiene supuestos indirectos. Primero, VirE2 y T-DNA no deberían interactuar en la bacteria, aunque ambos se sintetizan allí. De hecho, en AgrobacteriumEl citoplasma de VirD2-T-DNA y VirE2 no interactúan, y VirE2 solo se une al T-DNA una vez que está en el citosol de la planta [23]. En segundo lugar, la proteína VirE2 debería estar presente en el sitio de entrada del ADN-T, es decir, en la periferia de las células vegetales. Esto se puso de manifiesto mediante experimentos de inmunofluorescencia (Figura 4 B), lo que sugiere que VirE2 está correctamente localizado para ayudar a extraer el T-DNA cuando entra en el citosol de la planta. Finalmente, la interacción entre el ADNss unido a VirE2 y la red de microtúbulos rígidos podría proporcionar un punto de anclaje que facilitaría la transducción de fuerza mediada por VirE2 en una etapa temprana del proceso de translocación [14].

El ssDNA-VirD2 transferido se exporta fuera de la bacteria a través de un sistema de secreción de tipo IV (T4SS, azul claro) y llega al citoplasma de la célula huésped. Allí, la disposición cooperativa de VirE2 en una estructura helicoidal atrae activamente el ADN-T entrante hacia el citosol de la célula vegetal. Además, la gran velocidad de polimerización (& # x0223c1 & # x003bcm / s) media una rápida protección del T-DNA en el mismo momento en que entra en el citosol del huésped. IM: membrana interna, OM: membrana externa, PM: membrana plasmática.

Según nuestro modelo, que identifica a VirE2 como un factor esencial que atrae el ADN-T al citoplasma de la planta, la energía libre liberada tras la formación del complejo de nucleoproteínas permite que las proteínas VireE2 trabajen contra grandes fuerzas, que podrían ser necesarias para translocar T- ADN en el huésped (ver más abajo). La producción de energía mecánica se produce únicamente a través de la ganancia de energía libre durante la unión de VirE2 al ssDNA sin la necesidad de una fuente externa de energía, por ejemplo, hidrólisis de nucleótidos. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se obtiene un vistazo a las fuerzas implicadas en la translocación del ssDNA en la célula receptora. Su magnitud se compara con las fuerzas producidas por los motores moleculares de translocación del dsDNA (ver, por ejemplo, [24]). Otros mecanismos en competencia podrían tender a extraer el ADN del citosol del huésped. Por ejemplo, durante la conjugación, los pili pueden retraerse después de unirse a la célula huésped [25]. Además, durante la transferencia de ADN al huésped, el pilus Tipo IV de Neisseria gonorrhoeae puede sufrir una serie de ciclos de extensión y retracción, generando fuerzas de retracción de hasta unas pocas decenas de pN [25]. Por tanto, la unión de una proteína al ssDNA transferido para formar un complejo que evite el retroceso del ssDNA en el T4SS por tales fuerzas sería una gran ventaja.

Tato y col. han propuesto que la proteína de acoplamiento TrwB del Escherichia coli El sistema conjugativo R388 actúa como un motor molecular transportador de ssDNA impulsado por ATP [26]. Este análogo de VirD4 se encuentra en la membrana interna bacteriana y se cree que bombea ADNss a través del canal de secreción Tipo IV. Teniendo en cuenta la corta longitud de persistencia del ssDNA (& # x0223c0.7 nm) y la gran distancia entre la proteína de acoplamiento y la membrana del huésped (al menos 30 nm [27]), simplemente empujar el ssDNA flexible a través del T4SS sería ineficaz. La transferencia se facilitaría si VirE2 presente en el host también la hiciera pasar de forma activa.

Los experimentos de una sola molécula han demostrado que el filamento helicoidal de ADNc virE2-ssDNA & # x0201cfinal & # x0201d obtenido es una estructura muy estable y rígida. Lavar el complejo con tampón sin proteína VirE2 no desestabiliza el complejo. Pero in vivo, el desencadenamiento del filamento es necesario para la integración del ADN-T en el genoma nuclear de la célula receptora. Por lo tanto, la pregunta es cómo el complejo rígido VirE2-ssDNA se libera de VirE2. De hecho, la interacción muy estrecha entre VirE2 y el ssDNA y entre las moléculas de VirE2 parece necesitar un mecanismo de degradación específico para eliminar la proteína VirE2. Recientemente se demostró que VirE2 está específicamente dirigido a la degradación por el complejo Skp1-Cdc53-cullin-F-box que contiene VirF para la proteólisis [28]. El papel crítico de la degradación proteasomal en AgrobacteriumLa transformación genética mediada también fue evidente a partir de la inhibición de la expresión del ADN-T por un inhibidor proteasómico. En resumen, nuestros hallazgos y estos datos se correlacionan muy bien y explican por qué sería necesario un mecanismo de degradación tan específico.

El mecanismo único que Agrobacterium Las hazañas para translocar cualquier molécula de ADNss ha allanado el camino para la ingeniería genética de plantas y hongos, pero también ofrece nuevas posibilidades para la transferencia de genes a células de mamíferos [2]. sin embargo, el Agrobacterium El mecanismo de tracción propuesto aquí podría ser más general. No se basa en VirE2, pero necesita lo siguiente: (i) una proteína de unión de ssDNA que compacta el ssDNA tras la interacción y (ii) la aparición de esta actividad de unión de una sola hebra (SSB) solo en un compartimento. En los procesos de conjugación bacteriana y absorción de ADN, las proteínas SSB también están presentes y podrían tener una función importante. Por ejemplo, los homólogos de SBB (YwpH) se acumulan preferentemente en los polos celulares de B. subtilis [29]. Por tanto, estas proteínas podrían ser, al igual que VirE2, capaces de generar una fuerza sin una fuente externa de energía y tirar del ssDNA hacia el compartimento receptor.


5. CONCLUSIONES

Las limitaciones intrínsecas y los costos asociados con la administración viral y los vectores de vacunas, junto con una inmensa necesidad insatisfecha de nuevos genes in vivo y terapias contra el cáncer, hacen que los vectores no virales, como los conjuntos de ADN estructurado, sean atractivos para investigar sus propiedades únicas con respecto a las herramientas de administración preexistentes. Específicamente, aquí destacamos la geometría precisa de virus en 3D de los ensamblajes de ADN fabricados con origami de ADN andamiado, que ofrece la capacidad de controlar su tamaño en la escala de 10 a 100 nm, así como la organización espacial y el número de copias de ligandos de orientación que puede incluir péptidos, azúcares, aptámeros, lípidos y cualquier otro agente molecular, para controlar la avidez y la especificidad en el direccionamiento celular, la captación y el tráfico a través del reconocimiento biomolecular. Además, su versatilidad en la carga terapéutica génica que puede incluir ARNip, ASO, ARNm y CRISPR RNP con plantilla HDR incorporada hace que estos conjuntos sean de gran interés para investigar más a fondo en estudios preclínicos hacia una posible traducción clínica. Si bien ahora se resuelven muchos aspectos del diseño, la fabricación y la fabricación a las escalas requeridas para las aplicaciones preclínicas e incluso clínicas, quedan numerosas preguntas en torno a la biodistribución in vivo, la estabilidad, la focalización en tejidos / órganos / tumores y células, la estimulación de las células inmunitarias, la toxicidad y la depuración. . No obstante, debido a que el campo de los ensamblajes estructurados de ADN (y ARN) ha superado los desafíos preexistentes de diseño y fabricación, anticipamos una década altamente productiva de investigación preclínica próxima con la traducción clínica de estos nuevos agentes de administración y vacunas para inmunooncología y otras aplicaciones de importancia central para la salud humana.


La liberación de neurexina presináptica mediada por kinesina-3 estabiliza las espinas dendríticas en crecimiento y los componentes postsinápticos en vivo

Las propiedades funcionales de los circuitos neuronales están definidas por los patrones de conexiones sinápticas entre sus neuronas asociadas, pero los mecanismos que estabilizan la conectividad del circuito son poco conocidos. Examinamos sistemáticamente esta cuestión en las sinapsis de las espinas dendríticas recientemente caracterizadas de C. elegans Neuronas motoras GABAérgicas. Mostramos que la proteína de adhesión presináptica, neurexina / NRX-1, es necesaria para la estabilización de la estructura postsináptica. Encontramos que los eventos de desarrollo postsinápticos tempranos proceden sin un requisito estricto de actividad sináptica y no se ven interrumpidos por la eliminación de neurexina /nrx-1. Sin embargo, en ausencia de NRX-1 presináptico, las espinas dendríticas y los grupos de receptores se desestabilizan y colapsan antes de la edad adulta. Demostramos que kinesin-3 / UNC-104 entrega NRX-1 a terminales presinápticas y mostramos que se requiere una entrega continua para el mantenimiento postsináptico en animales maduros. Definiendo la dinámica y el orden temporal de los eventos de formación de sinapsis en vivo, describimos un mecanismo para estabilizar la conectividad del circuito maduro a través de la adhesión basada en neurexina.


Resumen

Además de las funciones biológicas críticas, el ADN también se considera un excelente material de ingeniería con características únicas de alta programabilidad y direccionabilidad. Los avances recientes en la nanotecnología del ADN permiten el diseño racional y la fabricación precisa de diversas nanoestructuras de ADN exquisitas, lo que brinda muchas oportunidades nuevas para usos tecnológicos. Mientras tanto, la integración de nanoestructuras de ADN con capacidad de reconocimiento molecular puede ampliar aún más el alcance de su aplicación. Particularmente adecuados para este objetivo, los aptámeros son ácidos nucleicos monocatenarios cortos seleccionados mediante un in vitro estrategia denominada evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial. Como análogos de los anticuerpos, los aptámeros pueden unirse a varios objetivos, como moléculas pequeñas, proteínas, virus, bacterias e incluso células completas. Aparte de la especificidad y afinidad comparables a las de los anticuerpos, los aptámeros tienen varias ventajas, que incluyen un peso molecular pequeño, una alta designabilidad, una síntesis fácil y una modificación conveniente. De hecho, la unión de aptámeros con nanoestructuras de ADN ha generado muchas herramientas poderosas para aplicaciones biológicas y biomédicas avanzadas. En esta revisión, resumimos el progreso, la aplicación y la perspectiva recientes de la nanotecnología de ADN integrada por aptámeros en los campos de la biodetección, la bioimagen, la administración de fármacos dirigida, la biorregulación y la biomimetismo.


Ver el vídeo: Delivery of Atorvastatin by Aptamer Gated Silica Nanoparticles in Atherosclerosis Cell Culture mode (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Lany

    Creo que estas equivocado. Puedo probarlo.

  2. Yozshushicage

    los análogos existen?

  3. Pyrrhus

    Lamento interferir, pero en mi opinión hay otra forma de resolver el problema.

  4. Kazirn

    Great, this is a very valuable message.

  5. Vanderbilt

    la idea brillante y es oportuna



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