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Fugas del promotor T7

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¿Se puede expresar un gen bajo el promotor T7 en una cepa de E. coli (por ejemplo, DH5 alfa), que no tiene el gen de la polimerasa T7 codificado en su genoma? En otras palabras, ¿el promotor T7 tiene fugas?

Para ser más específicos, ¿cómo es posible que una cepa de E. coli regular, que no codifica la polimerasa T7, pueda crecer en medios selectivos kan si se transformó con un plásmido que tiene el gen kanR bajo el promotor T7?


Aparentemente no, la filtración se puede controlar regulando estrechamente la polimerasa T7 con un promotor ajustado (en este caso, lacUV5).


Sistemas de expresión pET y pBAD

Este sistema se ha desarrollado para una variedad de aplicaciones de expresión, incluidos promotores híbridos, múltiples sitios de clonación para la incorporación de diferentes socios de fusión y sitios de escisión de proteasas. El plásmido pET, que se muestra en la Figura 1, es una construcción de 5,4 kb con los siguientes elementos:

  • códigos lacI para la proteína represora lac
  • Códigos ampR para resistencia a ampicilina
  • Ori col E1 origen de replicación
  • Códigos lacO para el operón lac
  • Códigos PT7 para el promotor T7, que es específico solo para la ARN polimerasa T7
  • Códigos TT7 para el terminador T7
  • El sitio de clonación múltiple de MCS tiene la secuencia que codifica la proteína de interés.

El uso de PT7, una secuencia de 20 nucleótidos que la E no reconoce, es una característica clave. En la secuencia del genoma procariótico, la ARN polimerasa de coli no ocurre, ni la ARN polimerasa de T7, por lo tanto, PT7 no se activa en ausencia de la ARN polimerasa de T7 y no se produce ninguna proteína de interés. Como se describe a continuación, cuando PT7 se activa como un promotor viral, se transcribe rápidamente, a una velocidad máxima de alrededor de 230 nucleótidos por segundo, unas cinco veces más rápido que el ARN de la polimerasa de E. Coli. La expresión requiere una cepa huésped bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG lisogenizado por un fragmento de fago DE3, que codifica la ARN polimerasa de T7, y en la Figura 2 se muestra un esquema del proceso.

Figura 2

Hay una copia del gen lacI que se encuentra en el genoma E. de coli y pET. LacI es un gen débilmente expresado y se logra un aumento de 10 veces de la represión cuando se emplea el promotor mutante LacIq que sobreexpresa.35 La proteína represora lac, LacI, reprime el promotor lacUV5 de la célula huésped y el promotor híbrido T7 / lac codificado. por el plásmido de expresión. El tetrámero lacI se une al operador lac tanto en el genoma de la célula huésped como en el plásmido en ausencia de un inductor. Esto evita que la célula huésped produzca ARN polimerasa T7 y evita que el plásmido produzca la proteína de interés. Se une y provoca la liberación de lacI tetramérica del operador lac tanto en el genoma como en el plásmido cuando se introduce el inductor, típicamente IPTG, que desencadena la expresión de la ARN polimerasa de T7 en la célula huésped. De esta forma, se inicia la transcripción del gen diana del promotor híbrido T7 / lac.

Puede producirse una expresión de fondo baja a partir de plásmidos de expresión de pET; esto puede reducirse mediante la coexpresión con el plásmido pLysS o pLysE de la lisozima T7, un inhibidor natural de la ARN polimerasa de T7. Con respecto al promotor afín sensible a tetraciclina (Tc), estos plásmidos albergan el gen de la lisozima T7 en orientaciones silenciosas (pLysS) y expresadas (pLysE).
Aunque el promotor lacUV5 es menos sensible que el promotor lac a la regulación del complejo cAMP-CRP (proteína receptora cAMP), la incorporación de glucosa al 1% en el medio de cultivo reduce los niveles de cAMP y mejora significativamente la represión del promotor. El control de la expresión de la proteína diana se mejora mediante cepas del hospedador deficientes en el gen lacY, que codifica la lactosa permeasa.

El sistema de expresión pBAD

La regulación del operón arabinosa en E. coli está dirigida por el producto génico de la arabinosa38, que controla la velocidad de síntesis de las proteínas AraE, AraF y AraG necesarias para la absorción de arabinosa, así como las enzimas necesarias AraB, AraA y AraD. por su catabolismo. Eso implica que el estado intrínseco de los promotores específicos de ara está apagado y AraC los enciende, mientras que el estado de conjunto del promotor del operón lac está encendido y el represor lac lo apaga. Además, pBAD es reprimido por catabolitos. Esto implica que el crecimiento del cultivo reprimirá aún más la expresión en presencia de glucosa. Si bien la expresión de un gen de plásmido clonado que contiene el promotor araBAD puede modularse en cultivos desarrollados en presencia de concentraciones de arabinosa sub-saturadas en varios órdenes de magnitud, las células individuales son completamente inducidas o no inducidas.

Las células que tienen el gen de transporte de arabinosa (araE) que se controla de forma nativa son inducidas o no, cuya fracción relativa está controlada por la concentración de arabinosa. En función de la concentración del inductor, la variación promediada de la población en la expresión de pBAD es proporcional al porcentaje de células que están completamente inducidas (frente a no inducidas) en lugar del nivel de expresión en células individuales. En E. coli, este fenómeno todo-orone, que puede tener efectos indeseables sobre la expresión de genes heterólogos, puede eliminarse mediante la expresión de araE a partir de promotores independientes de arabinosa.

Todas las células de la población tienen aproximadamente el mismo nivel de inducción en estas células modificadas por ingeniería de transporte de arabinosa.40 Por lo tanto, las cepas capaces de transportar L-arabinosa pero no metabolizarla, como una cepa de recA, endA, son las más apropiadas.
Los plásmidos de expresión basados ​​en el promotor araBAD están diseñados para un control estricto de la expresión de fondo y un control preciso de los niveles de expresión de la proteína objetivo. Esto contrasta con la inducción total o nula que han logrado la mayoría de los otros sistemas de expresión bacteriana. Un plásmido pBAD, derivado de pBR322 y que se muestra en la Figura 3, es una construcción de 4,1 kb que tiene los siguientes elementos:

  • araC ORF que codifica la proteína araC
  • Códigos ampR para resistencia a ampicilina
  • Ori col E1 origen de replicación
  • promotor pBAD araBAD
  • región de terminación de la transcripción rrnB
  • El sitio de clonación múltiple de MCS tiene la secuencia que codifica la proteína de interés.

En el operón de arabinosa, el dímero de AraC se une a tres sitios, I1, I2 y O2. En ausencia de arabinosa, 210 pares de bases cadena arriba de pBAD, el dímero AraC contacta con el sitio O2 ubicado dentro del gen araC. Como se muestra, la otra mitad del dímero araC contacta con el sitio I1 en la región promotora que forma el bucle de ADN. Por lo tanto, el bucle inhibe la transcripción de pBAD y el promotor de araC (pC). El dímero araC cambia su conformación al unirse a la arabinosa de modo que se une al sitio pBAD I2 en lugar del sitio O2. Esto elimina la estructura de bucle y la transcripción mediante lanzamientos de ARN polimerasa. La proteína receptora de AMPc (CRP) estimula la unión del dímero araC a los sitios I1 e I2, lo que significa que la represión de catabolitos mediada por glucosa puede reducir la expresión de fondo de araBAD.


Polimerasas de ARN

(a) Sistemas de expresión cromosómica.

Un gen de RNA Pol del fago puede integrarse de forma estable en el E. coli cromosoma a través de un lisógeno λ y expresado bajo el control inducible por IPTG del lacUV5 promotor. Una expresión oportuna del gen cromosómico T7 ARN Pol conduciría entonces la expresión del gen extraño ligado al promotor T7 clonado en un vector separado.

Cuando se usan células eucariotas como huéspedes, se puede diseñar una expresión cromosómica similar del gen del fago Pol mediante la transformación de las células con el ADN apropiado. Alternativamente, la expresión de la ARN polimerasa en el citoplasma puede dirigirse al núcleo para impulsar la expresión de un gen extraño localizado en el cromosoma. En tales sistemas de expresión cromosómica inversa, el gen de ARN del fago Pol transportado en un vector plasmídico (54) o vector de virus vaccinia (55) se expresa en células eucariotas (p. Ej., Células L de ratón y células NIH 3T3) a partir del promotor de metalotioneína de ratón o el promotor de vaccinia. , respectivamente. Luego, el ARN Pol se transporta al núcleo de las células de levadura o de mamíferos mediante la señal de localización nuclear ligada a la polimerasa (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val) del antígeno T grande de SV40 (50, 54, 56) . El ARN Pol de T7 sin modificar es principalmente citoplásmico y no puede dirigir un nivel detectable de expresión génica ligada al promotor de T7 en el núcleo. Sin embargo, cuando la polimerasa se sobreexpresa a un nivel de 0,5 a 1,5% de proteína celular total, algo de T7 RNA Pol puede entrar en el núcleo de forma pasiva. Se ha demostrado que la expresión de tales construcciones de T7 es al menos seis veces más eficaz que una expresión análoga dirigida desde el promotor RSV-LTR que se considera uno de los más fuertes conocidos en células de mamíferos.

Tenga en cuenta que varias líneas celulares de mamíferos exhiben un nivel considerable de expresión del promotor T7, incluso en ausencia de T7 RNA Pol. Esta expresión de fondo, que en realidad interfiere con la transcripción realizada por T7 RNA Pol, se debe a la unión de algunos factores nucleares al promotor T7, lo que permite la transcripción por RNA Pol II. El uso de promotores T7 mutantes, por ejemplo, con alteraciones simultáneas en −13 (A a T) y +1 (G a C), disminuye sustancialmente la unión del factor nuclear y, en consecuencia, aumenta la especificidad de la transcripción dependiente de Pol de ARN de T7 en células de mamíferos. hasta 10 veces (117).


Fugas del promotor T7 - ​​Biología

F. William Studier, científico senior emérito del Brookhaven National Laboratory, en 2004. En la década de 1980, Studier y un equipo de colaboradores descifraron detalles clave del bacteriófago T7 y convirtieron lo que aprendieron en un sistema para producir grandes cantidades de proteínas deseadas. La producción de las actuales vacunas de ARNm COVID-19 se basa en estos descubrimientos fundamentales.

Probablemente haya escuchado que las dos primeras vacunas aprobadas para combatir el COVID-19 en los Estados Unidos utilizan un enfoque relativamente nuevo: inyecciones de paquetes simples que contienen ARNm, un material genético que instruye a nuestras células para que produzcan proteínas de pico de coronavirus. Pero la tecnología para generar cantidades suficientes de esos paquetes de ARNm se remonta a la década de 1980, cuando F. William Studier, entonces biofísico senior del Departamento de Energía de EE. UU. Y el Laboratorio Nacional Brookhaven de rsquos, desarrolló una forma de aprovechar la maquinaria molecular de un virus muy diferente. .

El hecho de que el conocimiento científico y las herramientas desarrolladas hace décadas se estén utilizando ahora para producir las vacunas de ARNm que salvan vidas de COVID-19 es un gran ejemplo de cómo las inversiones a largo plazo del Departamento de Energía y las rsquos en investigación fundamental en nuestros Laboratorios Nacionales pueden mejorar la vida de los estadounidenses en la actualidad. y en el futuro ”, dijo el Dr. Steve Binkley, director interino de la Oficina de Ciencias del DOE & rsquos.

En la década de 1980, Studier, el difunto John Dunn y su grupo en el Departamento de Biología de Brookhaven Lab & rsquos completaron la secuenciación y anotación del genoma del bacteriófago T7. T7 es un virus que infecta E. coli bacterias y comanda esas células para hacer copias del virus. Tener la secuencia completa del genoma ayudó a los científicos a comprender cómo los genes T7 y otros elementos trabajan juntos para reproducir muchas copias del virus.

Poco tiempo después, Studier y su equipo encontraron una manera de dirigir la prolífica capacidad de copia de T7 & rsquos hacia la fabricación de otras cosas que no fueran más T7. Clonaron la ARN polimerasa T7, la enzima que transcribe los genes del ADN en ARN mensajero (ARNm), que indica a las células qué aminoácidos deben unirse para construir una proteína en particular. Luego, el equipo usó esta polimerasa de ARN T7 junto con un poderoso promotor T7 (un elemento genético que sirve como una señal & ldquostart & rdquo para la transcripción de genes) para producir grandes cantidades de ARN de casi cualquier gen. Estos ARN podrían usarse directamente, como en vacunas basadas en ARNm, o administrarse a ribosomas (células y fábricas de producción de proteínas) para traducirlos en proteínas, como en el sistema de expresión T7.

"Científicos de todo el mundo han utilizado el sistema de expresión Bill & rsquos & lsquoT7 y rsquo para producir grandes cantidades de proteínas o ARN de interés durante las últimas cuatro décadas", dijo Venki Ramakrishnan, biólogo estructural ganador del Premio Nobel del Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica, en Cambridge, Reino Unido. "Las nuevas vacunas de ARNm COVID-19 utilizan precisamente este sistema", dijo.

En las plantas de fabricación dirigidas por Pfizer / BioNTech y Moderna, los promotores y enzimas derivados de T7 producen kilogramos de ARNm de proteína de pico a la vez y dejan que nuestras propias células hagan la parte de producción de proteínas después de inyectar una dosis de instrucciones en nuestros brazos. .

El trabajo fundamental de & ldquoBill & rsquos hizo posible las vacunas de ARNm que salvan vidas, & rdquo Ramakrishnan.

Volver a lo básico

Este gráfico simplificado compara la infección por bacteriófago T7 con el sistema de expresión T7 desarrollado en Brookhaven Lab en la década de 1980 y el uso de elementos genéticos T7 para fabricar las vacunas actuales de ARNm COVID-19. Los tres utilizan el promotor T7 como señal para iniciar la transcripción de genes y la ARN polimerasa derivada de T7 para transcribir el código del ADN en instrucciones de ARNm que "le dicen" a los ribosomas cómo construir proteínas. En la infección por T7, el producto son nuevos virus (capas proteicas que encapsulan copias del ADN de T7 y otras proteínas virales). El sistema de expresión produce una proteína deseada particular. Para la vacuna, los ARNm se inyectan en nuestros brazos donde nuestro los ribosomas los utilizan para producir proteínas de pico COVID-19. Esos picos libres de virus entrenan a nuestro sistema inmunológico para que esté listo si tenemos que luchar contra el virus real.

William Studier no tenía visiones de fabricar vacunas cuando comenzó su investigación fundamental sobre el virus T7 como estudiante de posgrado en biofísica en el Instituto de Tecnología de California, ni mientras continuaba esta investigación después de unirse a Brookhaven Lab.

"IdquoT7 no era un bacteriófago bien estudiado cuando llegué a Brookhaven en 1964", dijo. “Lo estaba usando para estudiar las propiedades del ADN y decidí también estudiar su genética y fisiología molecular. Mi objetivo, por supuesto, era comprender todo lo posible sobre T7 y cómo funciona. & Rdquo

La clonación del gen de la ARN polimerasa T7 en 1983 fue particularmente difícil, señaló Studier.

& ldquoOtros lo habían intentado y fallado. Las empresas me habían preguntado si lo teníamos ”, dijo. "Entonces teníamos la secuencia de ADN y pensé que entendía por qué había fallado la clonación y cómo solucionar el problema".

Studier trabajó con Parichehre Davanloo, entonces becario postdoctoral, y Alan Rosenberg, miembro senior del laboratorio, para abordar el desafío. John Dunn purificó la ARN polimerasa T7 y demostró que produce grandes cantidades de ARN. Barbara Moffatt, entonces estudiante de posgrado, trabajó con Studier para convertir estos descubrimientos en el sistema de expresión T7.

& ldquoEl abogado de patentes de Brookhaven Lab sabía lo que estábamos haciendo y presentamos lo que creo que fue la primera patente en Brookhaven bajo la Ley Bayh-Dole & rdquo & # 8212, una ley aprobada por el Congreso en 1980 que permitía a las instituciones y a los beneficiarios otorgar patentes y derechos de licencia para invenciones derivadas a partir de una investigación financiada por el gobierno, explicó Studier.

El resto es historia. El sistema de expresión T7 pasó a convertirse en la tecnología más exitosa de Brookhaven Lab & rsquos, con laboratorios de investigación de todo el mundo que la utilizan y cientos de empresas que otorgan licencias de la tecnología para fabricar productos. Y aunque las patentes han expirado, T7 sigue siendo el sistema de referencia para los bioquímicos de todo el mundo.

& ldquoT7 RNA polimerasa puede sintetizar grandes cantidades de RNA a partir de cualquier DNA adyacente a un promotor T7 fuerte. "No sé si hay algo comparable", dijo Studier.

John Shanklin, presidente del Departamento de Biología de Brookhaven Lab & rsquos, está de acuerdo. & ldquoLa polimerasa T7 y el promotor son tan eficientes que hacen posible producir suficiente ARNm para millones de dosis de vacunas a la vez. Los descubrimientos de Bill & rsquos jugaron un papel muy importante al hacer posible escalar rápidamente la producción para proteger a las personas de todo el mundo del COVID-19. & Rdquo

Dos de esas personas recientemente vacunadas son Bill Studier y su esposa Sue.

"Me había preguntado casualmente si la ARN polimerasa T7 podría estar involucrada en la fabricación de las vacunas de ARN", reflexionó Studier, ahora un biofísico senior emérito. "La investigación básica casi siempre es útil, y me complace que mi trabajo haya sido útil para obtener potentes vacunas contra esta pandemia".

Presentación de diapositivas de imágenes históricas de William Studier, tomadas en 1970, 1972 (con Polly Winston), 1978 y 1984 (con John Dunn). Coloca el cursor sobre la imagen para ver los controles de la presentación de diapositivas.

F. William Studier obtuvo un B.S. en biofísica de Yale en 1958, seguido de un Ph.D. del Instituto de Tecnología de California en 1963. Trabajó como becario postdoctoral en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, y luego se unió al Departamento de Biología de Brookhaven Lab & rsquos en 1964 como biofísico asistente. A lo largo de los años, Studier ascendió en los rangos del departamento y rsquos, recibió la titularidad en 1971 y se convirtió en biofísico senior titular en 1974. Se desempeñó como presidente del Departamento de Biología de 1990 a 1999 y luego regresó a la investigación. También se desempeñó como profesor adjunto de bioquímica en la Universidad de Stony Brook. Sus logros han sido reconocidos por elección para la Academia Estadounidense de Artes y Ciencias en 1990, la Academia Nacional de Ciencias en 1992 y como Miembro de la Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia en 2007. En 2015 fue nombrado Científico Emérito Senior en Brookhaven Lab, y fue elegido miembro de la Academia Nacional de Inventores en 2018. Posee 15 patentes de las cuales 9 han sido licenciadas y comercializadas, incluidas las del sistema T7.

La investigación de Studier & rsquos en Brookhaven Lab fue apoyada por la Oficina de Ciencias del DOE (BER).


La ciencia detrás de la vacuna: herramientas biotecnológicas desarrolladas en el laboratorio de Brookhaven fundamentales para la fabricación de vacunas COVID-19

25 de mayo de 2021 13:16 ET | Fuente: Laboratorio Nacional de Brookhaven Laboratorio Nacional de Brookhaven

Upton, Nueva York, ESTADOS UNIDOS

Upton, NY, 25 de mayo de 2021 (GLOBE NEWSWIRE) - Probablemente haya escuchado que las dos primeras vacunas aprobadas para combatir el COVID-19 en los Estados Unidos utilizan un enfoque relativamente nuevo: inyecciones de paquetes simples que contienen ARNm, un material genético que instruye a nuestras células a producir proteínas de pico de coronavirus. Pero la tecnología para generar cantidades suficientes de esos paquetes de ARNm se remonta a la década de 1980, cuando F. William Studier, entonces biofísico senior del Laboratorio Nacional Brookhaven del Departamento de Energía de EE. UU., Desarrolló una forma de aprovechar la maquinaria molecular de un virus muy diferente. .

“El hecho de que el conocimiento científico y las herramientas desarrolladas hace décadas se estén utilizando ahora para producir las vacunas de ARNm que salvan vidas para COVID-19 es un gran ejemplo de cómo las inversiones a largo plazo del Departamento de Energía en investigación fundamental en nuestros Laboratorios Nacionales pueden mejorar las vidas de los estadounidenses. hoy y en el futuro ”, dijo el Dr. Steve Binkley, director interino de la Oficina de Ciencias del DOE.

En la década de 1980, Studier, el fallecido John Dunn y su grupo en el Departamento de Biología de Brookhaven Lab completaron la secuenciación y anotación del genoma del bacteriófago T7. T7 es un virus que infecta E. coli bacterias y comanda esas células para hacer copias del virus. Tener la secuencia completa del genoma ayudó a los científicos a comprender cómo los genes T7 y otros elementos trabajan juntos para reproducir muchas copias del virus.

Poco después, Studier y su equipo encontraron una manera de dirigir la prolífica capacidad de copia de T7 hacia la fabricación de otras cosas que no fueran más T7. Clonaron la ARN polimerasa T7, la enzima que transcribe genes de ADN en ARN mensajero (ARNm), que indica a las células qué aminoácidos deben unirse para construir una proteína en particular. Luego, el equipo usó esta ARN polimerasa T7 junto con un poderoso promotor T7 (un elemento genético que sirve como señal de "inicio" para la transcripción de genes) para producir grandes cantidades de ARN de casi cualquier gen. Estos ARN podrían usarse directamente, como en vacunas basadas en ARNm, o administrarse a los ribosomas (fábricas de producción de proteínas de las células) para traducirlos en proteínas, como en el sistema de expresión de T7.

"Los científicos de todo el mundo han utilizado el 'sistema de expresión T7' de Bill para producir grandes cantidades de proteínas o ARN de interés durante las últimas cuatro décadas", dijo Venki Ramakrishnan, biólogo estructural ganador del Premio Nobel del Laboratorio del Consejo de Investigación Médica de Molecular Biology, en Cambridge, Reino Unido. “Las nuevas vacunas de ARNm COVID-19 utilizan precisamente este sistema”, dijo.

En las plantas de fabricación dirigidas por Pfizer / BioNTech y Moderna, los promotores y enzimas derivados de T7 producen kilogramos de ARNm de proteína de pico a la vez, dejando que nuestras propias células hagan la parte de la producción de proteínas después de inyectar una dosis de instrucciones en nuestros brazos. .

"El trabajo fundamental de Bill hizo posibles las vacunas de ARNm que salvan vidas", dijo Ramakrishnan.

William Studier no tenía visiones de fabricar vacunas cuando comenzó su investigación fundamental sobre el virus T7 como estudiante de posgrado en biofísica en el Instituto de Tecnología de California, ni mientras continuaba esta investigación después de unirse a Brookhaven Lab.

"T7 no era un bacteriófago bien estudiado cuando llegué a Brookhaven en 1964", dijo. “Lo estaba usando para estudiar las propiedades del ADN y decidí también estudiar su genética y fisiología molecular. Mi objetivo, por supuesto, era comprender todo lo posible sobre T7 y cómo funciona ".

La clonación del gen de la ARN polimerasa T7 en 1983 fue particularmente difícil, señaló Studier.

“Otros lo intentaron y fracasaron. Las empresas me habían preguntado si lo teníamos ”, dijo. "Entonces teníamos la secuencia de ADN y pensé que entendía por qué había fallado la clonación y cómo solucionar el problema".

Studier trabajó con Parichehre Davanloo, entonces becario postdoctoral, y Alan Rosenberg, miembro senior del laboratorio, para abordar el desafío. John Dunn purificó la ARN polimerasa T7 y demostró que produce grandes cantidades de ARN. Barbara Moffatt, entonces estudiante de posgrado, trabajó con Studier para convertir estos descubrimientos en el sistema de expresión T7.

"El abogado de patentes de Brookhaven Lab sabía lo que estábamos haciendo y presentamos lo que creo que fue la primera patente en Brookhaven bajo la Ley Bayh-Dole", una ley aprobada por el Congreso en 1980 que permitía a las instituciones y a los beneficiarios otorgar patentes y derechos de licencia para invenciones derivadas de la investigación financiada por el gobierno, explicó Studier.

El resto es historia. El sistema de expresión T7 se convirtió en la tecnología más exitosa de Brookhaven Lab, con laboratorios de investigación de todo el mundo que la utilizan y cientos de empresas que otorgan licencias de la tecnología para fabricar productos. Y aunque las patentes han expirado, T7 sigue siendo el sistema de referencia para los bioquímicos de todo el mundo.

“La ARN polimerasa de T7 puede sintetizar grandes cantidades de ARN a partir de cualquier ADN adyacente a un promotor T7 fuerte. No sé si hay algo comparable ”, dijo Studier.

John Shanklin, presidente del Departamento de Biología de Brookhaven Lab, está de acuerdo. “La polimerasa T7 y el promotor son tan eficientes que hacen posible producir suficiente ARNm para millones de dosis de vacunas a la vez. Los descubrimientos de Bill jugaron un papel muy importante al hacer posible escalar rápidamente la producción para proteger a las personas de todo el mundo del COVID-19 ".

Dos de esas personas recientemente vacunadas son Bill Studier y su esposa Sue.

“Me había preguntado casualmente si la polimerasa de ARN T7 podría estar involucrada en la fabricación de las vacunas de ARN”, reflexionó Studier, ahora un biofísico emérito senior. "La investigación básica casi siempre es útil y me complace que mi trabajo haya sido útil para obtener vacunas potentes contra esta pandemia".

F. William Studier obtuvo un B.S. en biofísica de Yale en 1958, seguido de un Ph.D. del Instituto de Tecnología de California en 1963. Trabajó como becario postdoctoral en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, y luego se unió al Departamento de Biología del Laboratorio Brookhaven en 1964 como biofísico asistente. Con los años, Studier ascendió en las filas del departamento, recibió la titularidad en 1971 y se convirtió en biofísico senior titular en 1974. Se desempeñó como presidente del Departamento de Biología de 1990 a 1999 y luego regresó a la investigación. También se desempeñó como profesor adjunto de bioquímica en la Universidad de Stony Brook. Sus logros han sido reconocidos por elección para la Academia Estadounidense de Artes y Ciencias en 1990, la Academia Nacional de Ciencias en 1992 y como Miembro de la Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia en 2007. En 2015 fue nombrado Científico Emérito Senior en Brookhaven Lab, y fue elegido miembro de la Academia Nacional de Inventores en 2018. Posee 15 patentes de las cuales 9 han sido licenciadas y comercializadas, incluidas las del sistema T7.

La investigación de Studier en Brookhaven Lab fue apoyada por la Oficina de Ciencias del DOE (BER).


Bioquímica y Biología Molecular

4.14.3.3.1.2 Bombyx mori promotor de actina citoplasmática

Un potente casete de expresión de lepidópteros, pIE1 / 153A, se desarrolló recientemente en el laboratorio del Dr. Kostas Iatrou en la Universidad de Calgary. El casete utiliza la polilla de la seda ( B. mori) promotor del gen de la actina citoplásmica (Mounier y Prudhomme, 1986 Johnson et al., 1992), uno de los promotores celulares constitutivos más fuertes que también es activo en una variedad de líneas celulares de lepidópteros transfectadas. Sorprendentemente, se descubrió que la transcripción de este promotor celular estaba estimulada por el producto genético temprano inmediato (ie-1) de BmNPV, IE-1, un factor de transcripción capaz de estimular la in vitro tasa de transcripción del promotor de actina en trans hasta 100 veces (Lu et al., 1996). La estimulación del promotor de actina hasta en dos órdenes de magnitud también se obtuvo mediante la vinculación en cis la región de repetición homóloga 3 (HR3) de BmNPV en varias orientaciones en relación con el promotor de actina (Lu et al., 1997). Vinculación de la ie-1 gen y el elemento potenciador de HR3 con el promotor del gen de actina en el casete de expresión pIE1 / 153A dio como resultado una estimulación de la expresión del gen extraño dirigida por el promotor de actina en aproximadamente 5000 veces en ensayos de expresión transitoria para dos proteínas informadoras (Lu et al., 1997). Se han generado líneas celulares estables cotransfectando las células con el casete de expresión y un segundo plásmido que confiere resistencia a higromicina B, puromicina o G418. Los niveles de expresión reportados de proteínas secretadas de líneas celulares estables transformadas con este sistema han superado, con mucho, los obtenidos por el sistema de expresión de baculovirus (Farrell et al., 1998 Farrell et al., 1999). Además, el plásmido de expresión funciona en una amplia variedad de líneas celulares de lepidópteros, incluidas las derivadas de B. mori, T. ni, Plodia interpuntella, L. dispar, Mamestra brassicae, C. fumiferana, y S. frugiperda (Keith et al., 1999). El casete de expresión también es adecuado para protocolos de expresión transitoria ampliados que pueden producir decenas de miligramos de proteína recombinante por litro en 5 días después de la transfección (Farrel y Iatrou, 2004) (Figura 5), ​​evitando así el proceso laborioso y lento de selección de antibióticos estables y clonación de altos expresores. Los derivados del casete de expresión pIE1 / 153A están disponibles del Dr. Iatrou.

Figura 5 . Expresión transitoria y purificación por afinidad de fosfatasa alcalina secretada humana etiquetada con histidina (SEAP amablemente proporcionado por Eric Carpentier y Amine Kamen, Biotechnology Research Institute, Montreal, Canadá) a partir de una transfección mediada por lipofectina de células High Five ™ en cultivo en suspensión utilizando el pIE1 / 153A casete de expresión. En comparación con una serie de estándares de masa de albúmina de suero bovino en el gel teñido con azul de Coomassie, aproximadamente 50 μg ml -1 de SEAP estaban presentes en el sobrenadante del cultivo 5 días después de la transfección y producción en medio libre de proteínas ESF-921 (carril marcado "+" En comparación con el control marcado "-"). Se recuperaron dos miligramos de SEAP de una fracción de elución (E) después de la purificación por afinidad de iones Ni de 50 ml de sobrenadante de cultivo.


Fugas del promotor T7 - ​​Biología

Imagen: Mapa plásmido ilustrado en formato PNG

Archivo GenBank: Secuencia de plásmidos y anotaciones. Utilice un editor de texto o un software de mapeo de plásmidos para ver la secuencia.

Archivo SnapGene: Secuencia de plásmidos y anotaciones mejoradas de SnapGene. Úselo con el software SnapGene o el visor gratuito para visualizar datos adicionales y alinear otras secuencias.

Mapa de secuencia completo de Addgene para pCMV-T7-EGFP (BPK1098)

Imagen de mapa para pCMV-T7-EGFP (BPK1098)

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Expresión del promotor T7 - (19 / Jun / 2011)

Tengo un pañuelo para discutir con todos y espero compartir la ayuda de todos ustedes. Actualmente estoy realizando un estudio del vector de expresión de diseño de los genes que codifican la enzima biosíntesis de licopeno en E. coli. Aquí, la expresión del vector que utilizo es la pRSET-A y las cepas alfa DH5 alfa como célula huésped. El pRSET-A, el gen estará unido al sistema controlado por el promotor T7, este promotor requiere que se produzca la transcripción de la enzima T7 ARN polimerasa. Eso en la cepa alfa DH5 sin esta enzima. Sin embargo, obtuvimos la expresión de las colonias de licopeno. Entonces, ¿por qué sucede esto?

¿Tienes un "pañuelo"? jajaja. lo siento, solo bromeaba

Primero, ¿confirmó que la DH5 alfa carece de los genes que codifican la enzima biosíntesis de licopeno ?. Supuse que DH5 alfa contiene ese gen. así que cuando compruebes la expresión, por supuesto, obtendrás la proteína. Es muy importante lograr la compatibilidad entre el plásmido y el hospedador. Si desea expresar algún gen en e.coli, asegúrese de que exista dicho gen en ese hospedador. Si no está seguro de que DH5alpha contenga ese gen, primero intente cultivar la célula

1.Compruebe la expresión de DH5alpha sin plásmido.
2.Compruebe la expresión de DH5 alfa con el plásmido pRSET-A (no se agregó IPTG)
3.Haga una expresión de DH5 alfa con el plásmido PRSER-A y agregue algo de concentración de IPTG

Ok, lo que esperamos de esto:
si obtiene la banda para todos los carriles, significa el mismo nivel de expresión ... el tipo salvaje de DH5alpha contiene el gen que codifica la enzima,
si obtiene (3.) una expresión más gruesa, significa que el promotor T7 realmente funciona, ya que todos sabemos que la T7 puede inducirse por la presencia de IPTG. si ves que no hay diferencia entre (2) y (3) ... significa que la polimerasa T7 no es el problema aquí (ni siquiera un pañuelo. lol bromeando solamente). venía del anfitrión. el anfitrión capaz de expresar el gen (porque el gen está en el genoma con el promotor original).

así que si ese es el caso, intente utilizar otro E. coli que pierda ese gen. ¿Te lo dije claramente? El host correcto le mostrará los diferentes antes y después de inducir con IPTG

Esto es lo que estaba cruzado en mi mente

No creo que la E. coli produzca licopeno de forma nativa, pero podría estar equivocado. Lo más probable es que tenga una transcripción procedente de un promotor que no ha identificado. This could be a cryptic promoter in your operon, or read-through transcription from a promoter on the plasmid. You might try putting your operon in the reverse orientation in your plasmid. Or changing plasmids to one that reduces this read-through (Lucigen makes some, I believe).

I don't understand. how can putting the operon in reverse orientation in the plasmid can help?

p/s: hmn. lucigen. lately I heard people talked about it quite frequently. a new company?

If you have transcription activity arising from the plasmid, then the direction of the insert can determine if the transcript is in the sense or anti-sense direction. Lucigen is a U. Wisconsin Madison spinout that has been around for about 5-7 years, I think. They make a series of interesting cloning vectors.


Optimization of a T7-RNA polymerase system in Synechococcus sp. PCC 7002 mirrors the protein overproduction phenotype from E. coli BL21(DE3)

With the goal of expanding the diversity of tools available for controlling gene expression in cyanobacteria, the T7-RNA polymerase gene expression system from E. coli BL21(DE3) was adapted and systematically engineered for robust function Synechococcus sp. PCC 7002, a fast-growing saltwater strain. Expression of T7-RNA polymerase was controlled via LacI regulation, while functionality was optimized by both further tuning its expression level along with optimizing the translation initiation region of the expressed gene, in this case an enhanced YFP reporter. Under high CO2 conditions, the resulting system displayed a 60-fold dynamic range in expression levels. Furthermore, when maximally induced, T7-RNA polymerase-dependent protein production constituted up to two-thirds of total cellular protein content in Synechococcus sp. PCC 7002. Ultimately, however, this came at the cost of 40% reductions in both biomass and pigmentation levels. Taken together, the developed T7-RNA polymerase gene expression system is effective for controlling and achieving high-level expression of heterologous genes in Synechococcus sp. PCC 7002, making it a valuable tool for cyanobacterial research.

Puntos clave

• Promoter driving T7-RNA polymerase was optimized.

• Up to 60-fold dynamic range in expression, depending on CO 2 condiciones.


DISCUSIÓN

The conditional lethal system presented here consists of the streptavidin gene as a key suicide element. The biotin-binding ability of streptavidin in P. putida is notable because it requires not only proper peptide folding but also formation of the correct tetrameric structure. So far, there are only several genes that have been proven to be bactericidal upon expression in the members of genus Pseudomonas. These are genes encoding cell membrane destabilizing peptides Hok (E. coli plasmid R1) (22) and Gef (E. coli) (23), lysis genes of bacteriophages λ and φX174 (24), and the colE3 gene encoding an RNase (E. coli) (25). It is also worth mentioning that the T7 lysozyme maintains its T7 RNA polymerase inhibition ability in a heterologous P. putida sistema.

The rate of inactivation, a basic determinant of the efficiency of suicide designs, in our stv-based system is 10 −7 –10 −8 per cell per generation. This value is lower than those already reported for constructs based on single toxic functions (10 −2 –10 −6 ), even in E. coli, which is easier to contain (9, 23, 26, 27). It apparently reflects the very low basal level of streptavidin in cells. Despite the fact that the coupled T7 transcription/LacI-Olaca system is less leaky than the laca system alone (Table 1), an additional explanation of the better protection of cells against uninduced expression of the stv gene is synthesis of the antisense RNA originating from the Pmetro promotor. The lack of such protection, especially without a transcription terminator (e.g., LacI-Olaca complex) upstream of φ10 as in pVLTΔ-s02, resulted in a remarkably higher mutation frequency of 10 −4 –10 −5 per cell per generation. The LacI-Olaca complex formed upstream of the φ10 in pCC-s04 apparently interferes also with binding of bacteriophage RNA polymerase to the φ10 promoter (slower induction of the stv gene expression upon removal of 3MB) and further decreases the frequency of appearance of killing-resistant clones by reducing uninduced transcription of the stv gene. Preliminary data on the killing of E. coli by IPTG-induced expression of the stv gene suggest that, as expected, this system should be effective also in enteric bacteria.

A temperature shift from 30°C to 20°C alters the kinetics of the culture decay. This effect was more pronounced in a bacterial population depleted of 3MB in the absence of IPTG, indicating a contribution of both weaker interaction of T7 RNA polymerase with φ10 and the longer lifetime of the LacI repressor and/or its mRNA within a cell. Continuing decline of the culture after the addition of IPTG indicates a lower rate of mutational inactivation of the construct at 20°C than at 30°C.

The suicide design was tested under rich nutrient conditions—i.e., in LB medium containing some biotin. The growth conditions were favorable for cell survival, since killing occurs by depletion of biotin. In fact, slightly higher levels of IPTG-induced cell death were observed in minimal M9 medium (not shown). Under mostly starving conditions in, for instance, soil or seawater, this system may perform even more effectively. A SmaI fragment of pCC-s05 containing xylS2, lacI, y stv genes (Fig. 2B) has been already stably integrated into P. putida chromosome via mini-Tn5-mediated transposition (data not shown). Other known killing genes will be placed under control of φ10 promoter and integrated into the chromosome of P. putida <hsdR1 stv lacI xylS2 Kan r > to create multiple back up systems following incorporation of the T7 RNA polymerase-lysozyme regulatory module. Alternatively, stability of pRO-ilp upon induction of suicide in the absence of selection for plasmid maintenance can be achieved, for instance, by inserting into it the parB (hok/sok) locus of R1.

To summarize, additional regulatory circuits arranged to reduce the basal level of the expression of killing gene can remarkably increase the effectiveness of cell suicide machinery. Because of the general demand of biotin as a carboxyl carrier in the living world, the stv gene can serve as a universal cassette for programmed cell death. los stv-based system in combination with, for example, biotinylated solid supports and biotinylated fluorescent probes could also allow very sensitive monitoring of the presence of recombinant microorganisms.


Ver el vídeo: Fuga de prision (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Kigahn

    Está usted equivocado. Entra lo hablamos.

  2. Dak

    Estoy de acuerdo contigo. Hay algo en esto. Ahora todo se ha aclarado, gracias por su ayuda en este asunto.

  3. Renne

    SI, la variante buena

  4. Kazile

    como resultó no en vano =)

  5. Martel

    Estoy de acuerdo, este brillante pensamiento vendrá en el lugar correcto.

  6. Jorel

    ¿Deja que te ayuden?



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