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¿El pH afecta la constante de Michaelis?

¿El pH afecta la constante de Michaelis?


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He estado intentando confirmar el Km de un sustrato (que es 34 +/- 4 mM). Este valor se obtuvo en MOPS 50 mM, pH 6,3. Realicé mi ensayo de cinética en un tampón de pH 7 y obtuve un valor de Km en el 21,5. De acuerdo con este artículo, Fig. 2C, la actividad específica normalizada de la enzima es aproximadamente 70% a pH 6,3 y aproximadamente 47% a pH 7. Si divido 34 mM a pH 6,3 por 0,7 (lo que debería darme la Km óptima en el pH óptimo de 5.5) y luego multiplicar por 0.48, luego obtengo 23 mM. Sin embargo, el documento dice que Km está entre 30 y 38 mM, por lo que si divido 30 y 38 por separado por 0,7 y lo multiplico por 0,47, obtengo 20 y 25,6 mM respectivamente. Debido a que mi valor cae dentro de este rango, esto debe significar que tengo la enzima correcta y el mismo resultado que el papel.

Entonces mis preguntas son:

  1. Cuando el documento dice que Km es "34 +/- 4 mM", ¿puedo asumir que eso significa que el Km puede estar entre 30 y 38 mM? Me sorprende ver cuán amplio es el rango. Supuse que Km suele ser solo un valor con una desviación de 0,1 como máximo.

  2. ¿El pH cambia los valores de Km? Entiendo que el pH cambia la (s) forma (s) de la enzima y / o sustrato. Por lo tanto, eso debe afectar cuánto quiere adherirse al sustrato. Si el deseo de la enzima de unirse a un sustrato disminuye debido al aumento del pH, por ejemplo, eso significaría que se necesitan más sustratos para rodear la enzima, aumentando así la Km.

  3. Si el pH cambia de Km, ¿es así como determino el valor de Km de un valor de pH diferente si ya se conoce el valor de Km en otro pH? Sé que la actividad específica y la constante de Michaelis son diferentes, pero la cantidad de producto que se puede convertir por minuto depende de cuánto le guste a la enzima unirse a un sustrato, que está representado por la constante de Michaelis. ¿Mi razonamiento y cálculo llegaron a la conclusión correcta? Si no es así, ¿cómo se hace el cálculo?


De la derivación de la cinética de Michaelis-Menten se puede ver que:

$$ K_m = frac {k_f + k_ {cat}} {k_r} $$

Donde $ k_f $ y $ k_r $ son constantes de velocidad vinculante y no vinculante (para unión enzima-sustrato), respectivamente, y $ k_ {cat} $ es el número de rotación. Esto es para la aproximación de estado cuasi-estacionario (QSSA). Para la aproximación de equilibrio:

$$ K_m = frac {k_f} {k_r} $$ que es lo mismo que la constante de asociación.

En ambos casos, el pH puede afectar la velocidad de unión y desvinculación al afectar la afinidad entre la enzima y el sustrato. Por ejemplo, supongamos que el sitio de unión del sustrato está cargado negativamente. Un pH bajo aumentaría el potencial electrostático del sitio de unión del sustrato hacia cero al afectar la ionización de los grupos funcionales.

El pH también puede tener efectos indirectos sobre el sitio de unión del sustrato porque puede modificar la estructura general de la proteína.

Muchas reacciones catalizadas por enzimas implican catálisis ácido-base, es decir, hay una transferencia de protones. En reacciones como estas, el pH puede afectar $ k_ {cat} $.

Si el pH cambia de Km, ¿es así como determino el valor de Km de un valor de pH diferente si ya se conoce el valor de Km en otro pH?

Puede hacerlo haciendo un gráfico de Lineweaver-Burk para el pH modificado.


3.7: El efecto del pH sobre la cinética enzimática

De la misma manera que cada enzima tiene una temperatura óptima, cada enzima también tiene un pH óptimo en el que funciona mejor. Por ejemplo, la tripsina y la pepsina son enzimas del sistema digestivo que rompen las cadenas de proteínas de los alimentos en trozos más pequeños, ya sea en cadenas de péptidos más pequeños o en aminoácidos individuales. La pepsina actúa en las condiciones muy ácidas del estómago. Tiene un pH óptimo de aproximadamente 1,5. Por otro lado, la tripsina actúa en el intestino delgado, partes del cual tienen un pH de alrededor de 7,5. El pH óptimo de la tripsina es de aproximadamente 8.

Tabla ( PageIndex <1> ): pH para una actividad óptima
Enzima PH óptimo Enzima PH óptimo
Lipasa (páncreas) 8.0 Invertase 4.5
Lipasa (estómago) 4.0 - 5.0 Maltase 6.1 - 6.8
Lipasa (aceite de ricino) 4.7 Amilasa (páncreas) 6.7 - 7.0
Pepsina 1.5 - 1.6 Amilasa (malta) 4.6 - 5.2
Tripsina 7.8 - 8.7 Catalasa 7.0
Ureasa 7.0

Si piensa en la estructura de una molécula de enzima y el tipo de enlaces que puede formar con su sustrato, no es sorprendente que el pH deba importar. Suponga que una enzima tiene un pH óptimo de alrededor de 7. Imagine que a un pH de alrededor de 7, un sustrato se adhiere a la enzima a través de dos enlaces iónicos. En el siguiente diagrama, los grupos que permiten el enlace iónico son causados ​​por la transferencia de un ion hidrógeno de un grupo -COOH en la cadena lateral de un residuo de aminoácido a un -NH2 grupo en la cadena lateral de otro.

En este ejemplo simplificado, eso es igualmente cierto tanto en el sustrato como en la enzima.

Ahora piense en lo que sucede a un pH más bajo, en otras palabras, en condiciones ácidas. No afectará el -NH3 + grupo, pero el -COO - recogerá un ion de hidrógeno. Lo que tendrás será esto:

Ya no tiene la capacidad de formar enlaces iónicos entre el sustrato y la enzima. Si esos enlaces fueran necesarios para unir el sustrato y activarlo de alguna manera, entonces a este pH más bajo, la enzima no funcionará. ¿Qué sucede si tiene un pH superior a 7, en otras palabras, en condiciones alcalinas? Esta vez, el grupo -COO - no se verá afectado, pero el -NH3 El grupo + perderá un ion hidrógeno. Eso deja . . .

Nuevamente, no hay posibilidad de formar enlaces iónicos, por lo que la enzima probablemente tampoco funcionará esta vez. A pH extremos, puede suceder algo más drástico. Recuerde que la estructura terciaria de la proteína se mantiene unida en parte por enlaces iónicos como los que hemos visto entre la enzima y su sustrato. A pH muy altos o muy bajos, estos enlaces dentro de la enzima pueden romperse y perder su forma. Si pierde su forma, el sitio activo probablemente se perderá por completo. Esto es esencialmente lo mismo que desnaturalizar la proteína calentándola demasiado.


Michaelis constante

Dado que la concentración de sustrato en Vmax no se puede medir con exactitud, las enzimas deben caracterizarse por la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de su máximo. Esta concentración de sustrato se denomina constante de Michaelis-Menten (KM) también conocido como Michaelis constante. Esto representa (para reacciones enzimáticas que exhiben una cinética de Michaelis-Menten simple) la constante de disociación (afinidad por el sustrato) del complejo enzima-sustrato (ES). Los valores bajos indican que el complejo ES se mantiene unido muy fuertemente y rara vez se disocia sin que el sustrato reaccione primero para formar el producto.


Métodos

Configuración experimental en cultivo continuo

En contraste con muchos otros grupos que manejan cultivos por lotes de C. acetobutylicum, utilizamos cultivos continuos para estudiar el efecto del pH en la producción de solventes, en particular en la producción de butanol. Un proceso de fermentación que se puede operar continuamente tiene varias ventajas sobre un proceso por lotes en la fabricación industrial y biotecnológica: solo se necesita una serie de precultivos para un período de producción prolongado, la "temporada muerta" necesaria para el llenado, esterilización, enfriamiento y limpieza de el equipo se reduce en gran medida y el volumen del recipiente del fermentador se puede reducir sin pérdida de capacidad de producción [17]. La producción estable de disolventes se puede mantener durante mucho más tiempo en un medio sintético con limitación de fosfato en un cultivo de quimiostato que en el proceso por lotes tradicional [21].

Nuestro modelo se basa en experimentos de cambio dinámico de cultivo continuo. Los experimentos se realizaron de acuerdo con una configuración experimental estandarizada [16, 18] y utilizando procedimientos operativos estándar para extraer y manipular diferentes tipos de muestras. La tension C. acetobutylicum ATCC824 se cultivó en condiciones anaeróbicas a 37 ° C y los precultivos se prepararon como se describió anteriormente [18]. Los experimentos de quimiostato limitado en fosfato se realizaron en un sistema de fermentación BiostatB de 1,5 l (BBI, Melsungen, Alemania) con 0,5 mM de KH2correos4 y glucosa al 4% (peso / volumen) en el medio de suministro [22] y una tasa de dilución de D = 0.075 h -1. El pH externo en el medio de cultivo se ajustó y se mantuvo constante a pH 5,7 y pH 4,5 mediante la adición automática de KOH 2 M. El análisis de los productos de fermentación se realizó como se describió anteriormente [18]. Se realizaron tres experimentos individuales cambiando el cultivo de pH 5,7 a pH 4,5 (que llamamos experimentos de "cambio hacia adelante") y uno de pH 4,5 a pH 5,7 (el experimento de "cambio inverso"). Los datos se tomaron durante todo el tiempo de observación. Los datos biológicos se dan en el archivo adicional 1: Tablas S1 - S4.

Modelado dependiente del pH de la fermentación AB

Como se mencionó anteriormente, el metabolismo de la fermentación AB en C. acetobutylicum presenta dos fases metabólicas características, acidogénesis y solventogénesis. Jones y Woods [10] han publicado una representación detallada de las vías metabólicas correspondientes. Hasta el momento, solo se han publicado unos pocos modelos metabólicos que describen este proceso fermentativo. Papoutsakis [23] desarrolló un modelo estequiométrico que podría usarse para estimar las tasas de reacciones que ocurren dentro de las vías de fermentación AB de varias bacterias clostridiales (productoras de AB) en cultivo discontinuo. Sin embargo, es importante destacar que estos resultados no son transferibles a cultivos continuos como los cultivos de quimiostato utilizados en este estudio donde las células crecen exponencialmente en todas partes. Votruba et al. [24] formuló un modelo del proceso de fermentación para cultivos discontinuos sin incluir los metabolitos intermedios, restringiendo las variables a biomasa, glucosa y los productos finales y este modelo captura bien las dos fases. El análisis de flujo metabólico se ha aplicado desde entonces a la vía [25-27]. Los modelos cinéticos existentes que describen la dinámica de la fermentación ABE no buscan capturar el efecto del pH sobre la red metabólica: en Shinto et al. [28] (que en realidad considera Clostridium saccharoperbutylacetonicum) se supone que el cambio depende de la glucosa y los niveles de enzima se consideran constantes, mientras que en Li et al. [29] Se incorpora actividad enzimática, pero la regulación se alimenta directamente al modelo a partir de datos experimentales (en lugar de permitir que varíe libremente dentro del modelo o que otros componentes del modelo influyan en ella). Por lo tanto, hasta donde sabemos, el modelo presentado aquí es el primero en considerar el efecto del pH sobre la red metabólica.

La red metabólica reducida

A continuación presentamos un modelo de la fermentación AB en C. acetobutylicum en cultivo continuo. Debido a la falta de información publicada sobre los parámetros cinéticos que gobiernan estas reacciones en las condiciones utilizadas en nuestro trabajo experimental en la literatura, agregamos una serie de reacciones de la red metabólica publicadas por Jones y Woods [10]. Esto nos permite minimizar el número de parámetros que deben estimarse a partir del trabajo experimental al enfocar el modelo en aquellas reacciones que tienen más probabilidades de estar reguladas por el pH del ambiente. Por lo tanto, como se muestra en la Figura 1, cinco pasos glicolíticos se combinaron en una reacción (R1), asumiendo que hay un flujo constante de glucosa a acetil-CoA. Además, reducimos el número de pasos en otras cinco reacciones: las conversiones de acetil-CoA en dos moléculas de acetato (R2), de butiril-CoA en dos de butanol (R10), de butiril-CoA en dos de butirato (R8), y de acetil-CoA en dos de etanol (R5), reducimos dos pasos en uno. Finalmente, representamos los tres pasos en la conversión de acetoacetil-CoA a butiril-CoA por uno (R9). Todas las reacciones intermedias se enumeran en la Tabla 1.

Cuando la regulación génica no se incluye explícitamente en la representación de una reacción, empleamos expresiones de Michaelis-Menten. En la siguiente sección explicamos nuestro enfoque cuando la regulación génica se incluye explícitamente.

Incorporación de la regulación genética

Las reacciones necesarias para la solventogénesis están estrictamente reguladas a nivel genético: la producción de las enzimas necesarias para catalizar estas reacciones se puede activar o desactivar (o, más generalmente, aumentar o disminuir) a nivel transcripcional mediante la unión de proteínas reguladoras en el ADN apropiado. sitios. Los niveles de las proteínas reguladoras específicas se ajustan en respuesta a señales tanto internas como externas (por ejemplo, pH) que se transmiten a través de la célula. Por tanto, se espera que el cambio de la acidogénesis a la solventogénesis (o, de hecho, viceversa), pueda explicarse, al menos parcialmente, mediante la regulación del pH de los genes asociados a enzimas.

Las principales enzimas implicadas en la solventogénesis están codificadas por los genes. adc, adhE, bdhA / B, ctfA / B y thlA - consulte la Tabla 1. Observamos que hay dos adhE genes en C. acetobutylicum el que incorporamos en nuestro modelo a veces se denomina adhE1. Por las razones que se describen a continuación, incluimos la influencia de solo tres de estos genes en nuestro modelo dinámico, a saber adc, adhE y ctfA / B.

Expresión de la ctfA / B El gen da como resultado acetoacetil-CoA: acetato / butirato: CoA-transferasa [8] (o simplemente CoA-transferasa), que es la enzima responsable de convertir la acetoacetil-CoA y el acetato o butirato previamente secretado en acetoacetato y acetil-CoA o butiril-CoA, respectivamente. los adhE El gen es parte del mismo operón que ctfA / B, a saber, el Sol operón [30]. La deshidrogenasa AdhE cataliza la conversión de butiril-CoA y acetil-CoA en butanol y etanol, respectivamente [31, 32].

los adc El gen codifica la acetoacetato descarboxilasa (Adc), que es la enzima responsable de la descarboxilación del acetoacetato en acetona y CO2[14, 15]. Hay dos conocidos bdh genes: bdhA y bdhB los productos de ambos genes son butanol deshidrogenasas [33] que (además de AdhE) convierten butiril-CoA en butanol. Dado que sus funciones son similares a las de AdhE, sus efectos se pueden absorber en la elección de parámetros de AdhE. Por lo tanto, los descuidamos de nuestro modelo dinámico. El producto genético de thlA es una tiolasa que cataliza la conversión de acetil-CoA en acetoacetil-CoA y, por tanto, es necesaria tanto para la acidogénesis como para la solventogénesis [34]. Se especula que la expresión del thlA gen es constitutivo [35] y experimentos recientes indican que la diferencia en los niveles de transcripción de thlA entre la acidogénesis y la solventogénesis es mucho menos marcada que la de ctfA / B, adc, y adhE[36]. Por lo tanto, ThlA también se descuidó de nuestro modelo dinámico, ya que asumimos que los niveles de ThlA permanecen relativamente constantes a lo largo de los experimentos como se encuentra en [16]. los adc, adhE y ctfA / B los genes se regulan de acuerdo con la fase metabólica, y su transcripción aumenta en la fase solventogénica [36]. Por lo tanto, es probable que se induzcan a través de una señal relacionada con el pH y, por lo tanto, incorporamos cada uno de estos genes en el modelo. Suponemos que cada uno de ellos se transcribe a dos velocidades distintas: basal (r mi para la enzima E, ver la flecha de guiones hacia abajo en (1) a continuación) cuando el pH es suficientemente alto (de hecho, existen niveles bajos de estas transcripciones antes del inicio de la solventogénesis, ver por ejemplo [37, 38]) y en una tasa más alta (, vea la flecha punteada hacia arriba en (1)) cuando el pH del ambiente es bajo.

Suponemos que todas las reacciones enzimáticas se rigen por

dónde S es el sustrato, mi la enzima, C el complejo formado por S y mi, y PAG el producto resultante. Como en la derivación de la dinámica de Michaelis-Menten, asumimos que la concentración de C está en un estado cuasi-estacionario [13, 39] pero, por el contrario, no tomamos mi ser constante porque su producción está regulada por el pH [13]. Por lo tanto, cuando deseamos incluir la concentración de enzima explícitamente, usamos la teoría cinética convencional para obtener las siguientes ecuaciones [40]:

dónde α = k1·k2/(k-1 + k2), aunque las ecuaciones que involucran CtfA / B requieren el producto de tres variables en las ecuaciones (2a) y (2b) ya que las reacciones que cataliza involucran dos sustratos. La producción de la enzima está determinada por la tasa de expresión del gen correspondiente, ya que los mecanismos por los cuales se induce la solventogénesis no se han dilucidado por completo, incluimos un interruptor genérico dependiente del pH. F(pag) que activa el aumento de la producción de enzimas por debajo de un umbral de pH. El interruptor toma la forma de la función de paso suavizado,

dónde pag* representa el nivel de pH umbral alrededor del cual se produce el cambio y norte dicta la inclinación de la función de interruptor suave.

Dado que el pH se estableció y controló externamente en los experimentos de cambio dinámico, no introducimos una ecuación diferencial para esta variable. Para cada experimento, el pH se mide en puntos de tiempo regulares. Ajustamos una función (usando 'nlinfit' en Matlab [41]) de la forma

a los datos de pH, donde C1,C2 y C3 son constantes, para obtener una función distinta que represente el pH para cada simulación, esta función se introduce en el modelo a través de la función de interruptor F(pag).

Combinando la red metabólica dependiente del pH con la regulación genética

Cuando las concentraciones de enzima deben incluirse explícitamente, las reacciones toman la forma descrita en la sección anterior; de lo contrario, se adoptan las cinéticas de Michaelis-Menten. Por lo tanto, las reacciones que se muestran en la Figura 1 y la Tabla 1 están representadas por:

donde la velocidad límite de reacción i viene dada por y la correspondiente constante de disociación es. Incluimos la constante estequiométrica de dos en R1 ya que dos moléculas de acetil-CoA se forman a partir de una de glucosa. De manera similar, la constante 0.5 en R4 representa la formación de un acetoacetil-CoA a partir de dos acetil-CoA. El modelo metabólico resultante viene dado por:

donde hemos agregado a cada ecuación un término de flujo de salida que es el producto de la tasa de dilución con la concentración del metabolito correspondiente porque tenemos un flujo de salida constante tanto extracelular como intracelular (como resultado del flujo de salida celular) productos a través del quimiostato.

Además, requerimos las siguientes ecuaciones para representar las concentraciones de enzimas:

Ajustamos el modelo a los datos experimentales como se describe en la siguiente sección.

Normalización de datos, estimación de parámetros y simulación de modelos

Todos los parámetros se estiman a partir de tres experimentos "hacia adelante" utilizando SBToolbox en Matlab [42]. Como se mencionó anteriormente, se utilizan datos de GC de los experimentos de cambio dinámico, midiendo el tiempo hasta que el medio alcanza un cierto nivel de pH. El lapso de tiempo de todo el cambio difirió entre los experimentos, variando desde 22 (experimento 1 'hacia adelante', vea la Figura 2 (a)) a 33.5 horas (experimento 2 'hacia adelante', vea la Figura 2 (b)) vea el Archivo Suplementario 1 para los datos brutos. Por lo tanto, para tomar un promedio de los datos que se usarán para la estimación de parámetros, los datos tuvieron que normalizarse a lo largo del intervalo de cambio dinámico para que las comparaciones entre puntos de tiempo sean significativas (es decir, los puntos de tiempo para cada conjunto de datos deben corresponder a fases equivalentes, es decir, acidogénesis, el cambio dinámico o solventogénesis). Para lograr esto, los conjuntos de datos 1 y 3 se normalizaron en el conjunto de datos 2, es decir, los puntos de tiempo que ocurren durante el cambio dinámico se escalaron para que la fase de cambio dinámico dure 33,5 horas en todos los conjuntos de datos normalizados, los puntos de tiempo de la fase de solventogénesis se tradujeron de modo que el El inicio de la solventogénesis ocurre 33,5 horas después del inicio de la fase de cambio dinámico para todos los conjuntos de datos normalizados. Cada conjunto de datos se interpoló en puntos de tiempo idénticos, lo que permitió calcular el promedio de los tres conjuntos escalados para la estimación de parámetros, cuyos resultados se muestran en la Tabla 2. En todas las comparaciones entre los datos y las soluciones numéricas, los datos originales y no escalados se utilizan conjuntos.

Comparación de nuestro modelo (líneas continuas) con los datos de los experimentos de quimiostato de cambio dinámico (puntos). La Figura 2 (a) muestra los resultados del experimento de cambio dinámico "hacia adelante". Las dos repeticiones de este experimento de cambio dinámico "hacia adelante" se muestran en la Figura 2 (b) y la Figura 2 (c). Las células producen principalmente acetato y butirato cuando se cultivan a un valor de pH de 5,7. Durante la fase de transición C. acetobutylicum cambia su metabolismo (en función del pH externo) hacia la generación de los disolventes acetona y butanol a un pH de 4,5. El etanol se produce durante la acidogénesis y la solventogénesis en aproximadamente los mismos niveles. En la Figura 2 (d) demostramos la comparación del modelo y los datos para el experimento de cambio dinámico "inverso".

Análisis de estado estacionario de la red metabólica.

Con el fin de desarrollar estrategias de ingeniería genética para mejorar el rendimiento de butanol, deseamos examinar los cambios en los estados estacionarios de la red metabólica en respuesta a variaciones en las tasas de transcripción de los genes asociados con el solvente. Habiendo descuidado thlA, bdhA y bdhB A partir del modelo para estudiar la dinámica dependiente del tiempo con el fin de minimizar el número de parámetros a estimar para el modelo de tipo salvaje, los introducimos en los estudios de estado estacionario porque es posible que la sobreexpresión o subexpresión de estos genes tenga un efecto sobre el rendimiento del producto de fermentación. Por lo tanto, para variar explícitamente la expresión de estos genes, necesitamos derivar representaciones alternativas para las reacciones en las que están involucrados sus productos génicos, es decir, necesitamos parámetros para representar la producción de cada uno de estos genes. En estado estacionario, las concentraciones de ThlA y BhdA / B están dadas por r T / λ y r B/ λ, donde r T y r B son las tasas de producción mencionadas anteriormente, las últimas representan los niveles combinados de BdhA y BdhB (ambos desempeñan funciones equivalentes y, por lo tanto, es suficiente mirarlos en combinación). Entonces las tarifas R4 y R9 volverse

Sin embargo, observamos que la ecuación (7a) se requiere solo cuando se varía la tasa de producción de ThlA (es decir, en la Figura 3 (f)) en todas las demás simulaciones R4 viene dada por la expresión de Michaelis-Menten en la ecuación (4).

Curvas de estado estacionario de butanol (Bn) para la producción variable de (a) Adc (acetoacetato descarboxilasa), (b) y (c) CtfA / B (CoA-transferasa), (d) AdhE (alcohol aldehído deshidrogenasa), ( e) BdhA y / o BdhB (butanol deshidrogenasas) y (f) ThlA (tiolasa). En (c) hemos alterado los ejes de (b) para poder ver claramente el efecto de la regulación a la baja de ctfA / B.

Para simplificar, asumimos que las tasas de unión de butiril-CoA con BdhA y BdhB son las mismas (lo que significa que podemos considerar el nivel combinado de proteínas Bdh) y que esta tasa es la misma que entre butiril-CoA y AdhE. Tampoco incluimos una tasa de unión entre acetil-CoA y ThlA. Estos supuestos no reducen la generalidad de los resultados de estado estacionario ya que solo aparecen las relaciones de unión y producción a dilución y no se imponen tales restricciones a los valores de estas relaciones. Dado que en esta sección no nos ocupamos del comportamiento dependiente del tiempo del sistema (la fermentación de butanol a gran escala presumiblemente se llevaría a cabo en un cultivo continuo con el sistema, por lo tanto, en estado estacionario), asociamos una tasa de producción única, con cada enzima asociada al disolvente, esta tasa es diferente para cada enzima y es la suma de la tasa de producción basal (r mi para la enzima E), que se produce independientemente del pH, y la velocidad de producción inducida por pH bajo más rápida () que se produce durante la solventogénesis, es decir. En la Tabla 3, mostramos los valores de estas tasas de producción de enzimas combinadas que corresponden a las utilizadas para el modelo dinámico asociado al tipo salvaje.


El efecto del pH sobre la actividad, termocinética e inhibición de la polifenol oxidasa del melocotón.

Este estudio se centró en el efecto del pH sobre la actividad, termocinética e inhibición de la polifenol oxidasa (PPO) de la pulpa de melocotón mielada con (+) - catequina como sustrato. El pH óptimo para la actividad de la PPO fue de alrededor de 6,5 a 7,0, y la temperatura óptima dependió del pH y fue de 40 ° C a un pH de 6,8 mientras que de 30 ° C a un pH de 4,0. La enzima se mantuvo estable en el rango de pH de 6,0 a 8,0 durante el almacenamiento a 4 ° C. Sin embargo, los parámetros termocinéticos (D, z, k, Ea) de PPO sugirió que la enzima era mucho más estable a pH 6,8 que a pH 6,0 y pH 8,0 durante los tratamientos térmicos. Además, los resultados también indicaron que la enzima era más sensible al cambio de temperatura a pH 6,8 que a los demás pH. El estudio de inhibición indicó que la L-cisteína y el glutatión fueron altamente efectivos para la inhibición de la enzima, mientras que el NaF inhibió moderadamente a pH 6,8. Sin embargo, las capacidades de inhibición de esos inhibidores dependían del pH, y el medio ácido podría aumentar en gran medida la capacidad de inhibición del NaF para la PPO de pulpa de melocotón.

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FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Aquí hay solo un resumen rápido sobre los factores que afectan la actividad de las enzimas.

¿CUÁLES SON LOS FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS?

¿CÓMO AFECTA LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS?

A medida que aumenta la concentración de sustrato, aumenta la velocidad a la que se forma el complejo de sustrato enzimático porque hay más sustrato disponible para que las enzimas libres se unan al sitio activo. También con un aumento en la concentración de sustrato, mayor es la frecuencia de colisión del sustrato con el sitio activo de la enzima. Sin embargo en Vmax todo el sitio activo de la enzima está ocupado por sustrato, por lo tanto, la velocidad de reacción es constante, por lo que el aumento de [S] no afecta la velocidad de reacción. Al observar los efectos de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, las siguientes variables deben mantenerse constantes: pH, temperatura y concentración de enzima. El efecto de la concentración de sustrato se puede ilustrar utilizando la gráfica de Burk (ecuación) o la gráfica de Michaelis-Menten (ecuación).

FIGURA 1: ILUSTRA EL EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

¿CÓMO AFECTA EL pH A LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS?

Cuando el pH es demasiado ácido o demasiado básico para una enzima, sus enlaces de hidrógeno comienzan a romperse, lo que hace que el sitio activo de la enzima pierda su forma. Cada enzima opera dentro de un rango de pH (pH óptimo). Por ejemplo: la lipasa en el estómago opera dentro del pH óptimo 4-5.

FIGURA 2: ILUSTRA EL EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS.

¿CÓMO AFECTA LA TEMPERATURA A LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS?

A medida que aumenta la temperatura, la velocidad de reacción aumenta, sin embargo, más allá del punto de temperatura óptima, la velocidad de la reacción catalizada por enzima disminuye porque se rompen el enlace de hidrógeno y la interacción hidrófoba en la estructura de la enzima. Cuando esto ocurre, la enzima pierde su forma y el sustrato es incapaz de unirse adecuadamente al sitio activo, reduciendo así la actividad de la enzima. Además, a medida que aumenta la temperatura, aumenta la cantidad de energía cinética en el sistema, aumentando así la velocidad de reacción, ya que aumenta la frecuencia de colisión entre el sustrato y el sitio activo de la enzima. Además, a medida que aumenta la temperatura, las moléculas del sustrato ganan más energía para superar la barrera de activación, formando así más complejo ES que aumenta alternativamente la velocidad de reacción enzimática.

FIGURA 2: ILUSTRA EL EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS.

¿CÓMO AFECTAN LOS INHIBIDORES LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA?

Existen inhibidores irreversibles e inhibidores reversibles que afectan la velocidad de reacción enzimática. Los inhibidores reversibles se unen a la enzima mediante un enlace no covalente, por lo que la dilución del complejo enzima-inhibidor libera el inhibidor y la enzima puede continuar su actividad. Hay cuatro tipos de inhibidores reversibles: competitivos, no competitivos, mixtos y no competitivos.

1. Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por el sitio activo, por lo tanto, la forma del inhibidor se asemeja a la forma del sustrato. Cuando el inhibidor se une al sitio activo, reduce la velocidad de la reacción enzimática, ya que los sustratos no pueden unirse al sitio activo porque el inhibidor ocupa actualmente el sitio activo. El inhibidor competitivo aumenta Km, por lo que se necesita más sustrato para alcanzar ½ Vmax. Sin embargo, la Vmax no se ve afectada por el inhibidor competitivo.

FIGURA 3: ILUSTRA EL EFECTO DEL INHIBIDOR COMPETITIVO SOBRE Vmax Y Km EN LÍNEA DE BURK.

2. El inhibidor no competitivo se une a la enzima libre o complejo ES que no se une al sitio activo. Por tanto, la forma del inhibidor es diferente a la del sustrato. Este tipo de inhibidor reduce la capacidad de la enzima para convertir el sustrato en producto. Vmax se reduce y Km permanece igual, ya que el sustrato todavía puede unirse al sitio activo así como antes de que esté presente el inhibidor.

FIGURA 4: ILUSTRA EL EFECTO DEL INHIBIDOR NO COMPETITIVO SOBRE Vmax Y Km EN LA CURVA MICHAELLIS MENTEN Y LA PARCELA LINEWEAVERBURK RESPECTIVAMENTE.

3. El inhibidor no competitivo ocurre cuando el inhibidor se une solo al complejo ES. No se unen a las enzimas libres. Reduce tanto Vmax como Km en la misma cantidad. La pendiente del gráfico permanecerá constante porque tanto Km como Vmax cambiarán proporcionalmente entre sí y, por lo tanto, simplemente se observará que la línea se desplaza hacia arriba y hacia la izquierda.

FIGURA 5: ILUSTRA EL EFECTO DE UN INHIBIDOR NO COMPETITIVO SOBRE Km Y Vmax EN UNA PARCELA DE BURK EN LINEA.

4. El inhibidor mixto se une a la enzima libre o al complejo de sustrato enzimático. No se vinculan al sitio activo. Cuando el inhibidor se une a las enzimas, cambia la forma de la enzima, reduciendo así la afinidad del sustrato por el sitio activo de la enzima. Vmax siempre se reduce, mientras que Km aumenta o disminuye.

El inhibidor mixto puede parecer similar al inhibidor no competitivo, sin embargo, son diferentes. Cuando los inhibidores no competitivos se unen a las enzimas, forman el complejo EIS que hizo que no se formara el producto, mientras que en el inhibidor mixto, cuando el inhibidor se une a la enzima que forma el complejo EIS, todavía se forman algunos productos aunque el inhibidor esté presente.

FIGURA 6: ILUSTRA EL EFECTO DEL INHIBIDOR MIXTO EN Km Y Vmax UTILIZANDO UNA PARCELA DE BURK EN LINEA.


Cinética: ¿por qué un cambio en la concentración no afecta la constante de velocidad?

Un aumento de temperatura y el uso de catalizadores aumentan la velocidad de reacción y, por lo tanto, la velocidad constante, pero aunque un aumento de la concentración también aumenta la velocidad de reacción, ¿por qué? no ¿Afecta la tasa constante?

no importa, he encontrado la respuesta:

"La ecuación de velocidad muestra la relación entre la concentración de reactivos y la velocidad de reacción.

Si la concentración de uno de los reactivos aumenta, la velocidad de reacción también aumentará, la velocidad constante, k no cambiará.

Si la presión aumenta, la concentración de todos los reactivos aumentará y, por lo tanto, también aumentará la velocidad de reacción. Nuevamente, la constante de velocidad no cambiará.

Por tanto, la constante de velocidad k es independiente de la concentración y la presión.

Sin embargo, si la temperatura aumenta o se agrega un catalizador, la velocidad de reacción aumenta sin un cambio en la concentración, por lo que debe ser la constante de velocidad, k, la que está cambiando.

Por tanto, la constante de velocidad k varía con la temperatura y también se ve afectada por la adición de un catalizador ".

Para cualquier otra persona que tuviera el mismo problema.

¿No es lo que estás buscando? Try & hellip

Mira la ecuación de Arrhenius. La constante de velocidad depende de la presencia / ausencia de catalizador y la temperatura.

enk = -Ea / RT + lnA
y = mx + c
(La ecuación de Arrhenius).
Como puede ver, la concentración no aparece en esta ecuación.
enk = logaritmo natural de la constante de velocidad (k)
Ea = energía de activación
R = constante relativa de los gases (8.314)
T = temperatura, kelvin.
lnA = logaritmo natural del factor preexponencial A (no se preocupe por lo que es).

Utiliza esta ecuación en A2 para encontrar la energía de activación (y a veces A) de los gráficos.

Otra forma de saber que la concentración no afecta la constante de velocidad es la ecuación de velocidad "más simple":

Tasa =k [M] m [N] n donde myn son los órdenes de los reactivos (básicamente el efecto que el aumento de la concentración de estos reactivos tiene sobre la reacción general). Los corchetes representan las concentraciones de los reactivos.

Como se puede ver, índice se ve afectado por la concentración; si [M] aumentara, también lo haría la tasa porque k and [N] are being multiplied by a larger number.
Pero, k in itself isn't affected by concentration. It is the rate constant for a reaction at a given temperature.
Think about the kinetics of a reaction. Increasing concentration means there are more molecules/atoms in a certain volume, increasing the likelihood of molecules colliding, but not affecting the number of molecules above activation energy.
However, increasing temperature means that more molecules are above activation energy (look at Boltzmann distributions).
This links back to the Arrhenius equation, which talks about activation energy but not concentration- hence catalysts and temperature does change the rate constant.

Sorry this is badly explained, it's been a while since I did this rate constant nonsense XD


How pH Affects Enzymes

A pH environment has a significant effect on an enzymes. It can affect the intramolecular forces and change the enzyme's shape -- potentially to the point where it is rendered ineffective. With these effects in mind, typical enzymes have a pH range in which they perform optimally. For example, alpha amylase, which found in the mouth, operates most effectively near a neutral pH. However, lipases operate better at more basic pH levels. Buffer systems built into most organisms prevent pH levels from reaching the point where essential enzymes are rendered ineffective. If an enzyme is rendered ineffective by pH level, adjusting the pH can cause the enzyme to become effective again.


Does pH affect Michaelis constant? - biología

THE EFFECT OF CHANGING CONDITIONS IN ENZYME CATALYSIS

This page looks at the effect of changing substrate concentration, temperature and pH on reactions involving enzymes. It follows on from a page describing in simple terms how enzymes function as catalysts. Please remember that this series of pages is written for 16 - 18 year old química students. If you want something more advanced, you are looking in the wrong place.

Nota: This page assumes that you have already read the page about how proteins function as enzymes. If you have come straight to this page via a search engine, you really ought to go back and read that page first. In fact, unless you already have a good knowledge of protein structure, you may have to go back further still to a page about the structure of proteins.

The effect of substrate concentration on the rate of enzyme-controlled reactions

Remember that in biology or biochemistry, the reactant in an enzyme reaction is known as the "substrate".

What follows is a very brief and simple look at a very complicated topic. Anything beyond this is the stuff of biochemistry degree courses!

A reminder about the effect of concentration on rate in ordinary chemical reactions

If you have done any work on rates of reaction (especially if you have done orders of reaction), you will have come across cases where the rate of reaction is proportional to the concentration of a reactant, or perhaps to the square of its concentration.

You would discover this by changing the concentration of one of the reactants, keeping everything else constant, and measuring the initial rate of the reaction. If you measure the rate after the reaction has been going for a while, the concentration of the reactant(s) will have changed and that just complicates things. That's why initial rates are so useful - you know exactly how much you have of everything.

If you plotted a graph of initial reaction rate against the concentration of a reactant, then there are various possibilities depending on the relationship between the concentration and the rate.

If the rate is independent of the concentration

This is called a zero order reaction.

If the rate is proportional to the concentration

This is called a first order reaction.

If the rate is proportional to some power of the concentration greater than one

In this case, you get a curve. If the rate was proportional to the square of the concentration, that's a second order reaction.

With reactions controlled by enzymes, you get a completely different type of graph.

Plotting initial rates of enzyme-controlled reactions against substrate concentration

The graph for enzyme controlled reactions looks like this:

Two minor things to notice before we discuss it . . .

Biochemists talk about a reaction velocity instead of a reaction rate. If you have done any physics, you will know that this is a complete misuse of the word "velocity"! But that's what you will find in biochemistry sources, so that's what we will have to use.

So why is the graph the shape it is?

For very, very low substrate concentrations, the graph is almost a straight line - like the second chemistry rate graph above. In other words, at very, very low concentrations, the rate is proportional to the substrate concentration.

But as concentration increases, increasing the concentration more has less and less effect - and eventually the rate reaches a maximum. Increasing the concentration any more makes no difference to the rate of the reaction.

If you know about orders of reaction, the reaction has now become zero order with respect to the substrate.

The reason for this is actually fairly obvious if you think about it. After a certain concentration of substrate is reached, every enzyme molecule present in the mixture is working as fast as it can. If you increase the substrate concentration any more, there aren't any enzyme molecules free to help the extra substrate molecules to react.

Is this unique to enzyme-controlled reactions? ¡No! It can happen in some ordinary chemistry cases as well, usually involving a solid catalyst working with gases. At very high gas pressures (in other words, very high concentrations of gas molecules), the surface of the catalyst can be completely full of gas molecules. If you increase the amount of gas any more, there isn't any available surface for it to stick to and react.

The maximum rate for a particular enzyme reaction is known as Vmax. (That's V for velocity - a bit confusing for chemists where V is almost always used for volume!)

This is easily measured by drawing a line on the graph:

This is sometimes reported as a "turnover number", measured as the number of molecules of substrate processed by a single enzyme molecule per second, or per minute.

KMETRO is known as the Michaelis constant or the Michaelis-Menten constant (for reasons which needn't concern us), and is a useful measure of the efficiency of an enzyme.

KMETRO is the concentration of the substrate in mol dm -3 which produces a reaction rate of half Vmax. So it is found like this . . .

A low value of KMETRO means that the reaction is going quickly even at low substrate concentrations. A higher value means the enzyme isn't as effective.

Nota: You might possibly wonder why you have to go to the trouble of halving the maximum rate to get this information. Couldn't you just find the concentration of the substrate which produced the maximum rate?

If you look at the shape of the graph, it would be impossible to get any accurate measure of the concentration which first produced a maximum rate. The curve just gradually gets closer and closer to the horizontal, and there is no clear cut-off point at which it suddenly becomes horizontal.

The effect of temperature on the rate of enzyme-controlled reactions

A reminder about the effect of temperature on rate in ordinary chemical reactions

Remember that for molecules to react, they have to collide with an energy equal to or greater than the activation energy for the reaction.

Heating a reaction makes the molecules move faster and so collide more often. More collisions in a given time means a faster reaction.

But far more importantly, increasing the temperature has a very big effect on the number of collisions with enough energy to react. Quite a small temperature rise can produce a large increase in rate.

As a reasonable approximation for many (although not all) reactions close to room temperature, a 10°C increase in temperature will double the rate of a chemical reaction. This is only an approximation - it may take 9°C or 11°C or whatever, but it gives you an idea of what to expect.

Nota: If you aren't sure about any of this, have a quick look at the page about the effect of temperature on rates of reaction.

Use the BACK button on your browser to come back here afterwards.

Plotting rates of enzyme-controlled reactions against temperature

For low temperatures up to about 40°C, enzyme-controlled reactions behave much as you would expect any other chemical reaction to behave. But above about 40°C (the exact temperature varies from enzyme to enzyme), there is a dramatic fall in reaction rate.

A typical graph of rate against temperature might look like this:

The temperature at which the rate is fastest is called the temperatura optima for that enzyme.

Different enzymes have different optimum temperatures. Some enzymes, for example, in organisms known as thermophiles or extremophiles are capable of working at temperatures like 80°C or even higher.

The optimum temperature for a particular enzyme varies depending on how long it is exposed to the higher temperatures. Enzymes can withstand temperatures higher than their normal optimum if they are only exposed to the higher temperatures for a very short time.

Explaining the rate against temperature graph

At lower temperatures, the shape of the graph is exactly what you would expect for any reaction. All that needs explaining is why the rate falls above the optimum temperature.

Remember that the enzyme works because its substrate fits into the active site on the protein molecule. That active site is produced because of the way the protein is folded into its tertiary structure.

Heating an enzyme gives the protein chains extra energy and makes them move more. If they move enough, then the bonds holding the tertiary structure in place will come under increasing strain.

The weaker bonds will break first - van der Waals attractions between side groups, and then hydrogen bonds. As soon as these bonds holding the tertiary structure together are broken, then the shape of the active site is likely to be lost.

Obviously, the longer the enzyme is held at the higher temperature, the more time there is for the enzyme structure to be broken up. Given enough time and high enough temperatures, the enzyme structure is broken permanently. The enzyme is said to be desnaturalizado. For example, boiling an egg for 5 minutes denatures the proteins in the egg. Once that has happened, you can't un-boil it by cooling it!

The effect of pH on the rate of enzyme-controlled reactions

In the same way that every enzyme has an optimum temperature, so each enzyme also has an optimum pH at which it works best.

For example, trypsin and pepsin are both enzymes in the digestive system which break protein chains in the food into smaller bits - either into smaller peptide chains or into individual amino acids.

Pepsin works in the highly acidic conditions of the stomach. It has an optimum pH of about 1.5.

On the other hand, trypsin works in the small intestine, parts of which have a pH of around 7.5. Trypsin's optimum pH is about 8.

If you think about the structure of an enzyme molecule, and the sorts of bonds that it may form with its substrate, it isn't surprising that pH should matter.

Suppose an enzyme has an optimum pH around 7. Imagine that at a pH of around 7, a substrate attaches itself to the enzyme via two ionic bonds. In the diagram below, the groups allowing ionic bonding are caused by the transfer of a hydrogen ion from a -COOH group in the side chain of one amino acid residue to an -NH2 group in the side chain of another.

In this simplified example, that is equally true in both the substrate and the enzyme.

Now think about what happens at a lower pH - in other words under acidic conditions.

It won't affect the -NH3 + group, but the -COO - will pick up a hydrogen ion.

What you will have will be this:

You no longer have the ability to form ionic bonds between the substrate and the enzyme. If those bonds were necessary to attach the substrate and activate it in some way, then at this lower pH, the enzyme won't work.

What if you have a pH higher than 7 - in other words under alkaline conditions.

This time, the -COO - group won't be affected, but the -NH3 + group will lose a hydrogen ion.

Again, there is no possibility of forming ionic bonds, and so the enzyme probably won't work this time either.

Nota: If you think about it, this argument only works using ionic bonding if the enzyme has an optimum pH around 7. Under fairly acidic or alkaline conditions, all the charges present in the enzyme and substrate would be the same - as in the examples above.

Under those circumstances, you would be looking at other sorts of bonding - hydrogen bonding, for example, perhaps involving hydrogen bonds between an ion on one of either the enzyme and substrate, and a suitable hydrogen atom or lone pair on the other.

The example given is easy to follow. Don't worry about complications at this level. As long as you can see why changing the pH might affect a simple case, that's all you need.

At extreme pH's, something more drastic can happen. Remember that the tertiary structure of the protein is in part held together by ionic bonds just like those we've looked at between the enzyme and its substrate.

At very high or very low pH's, these bonds within the enzyme can be disrupted, and it can lose its shape. If it loses its shape, the active site will probably be lost completely. This is essentially the same as denaturing the protein by heating it too much.

This enzyme topic continues onto a final page about enzyme inhibitors.

Preguntas para poner a prueba su comprensión

Si esta es la primera serie de preguntas que ha hecho, lea la página de introducción antes de comenzar. Deberá usar el BOTÓN ATRÁS en su navegador para volver aquí después.


Human pancreatic alpha-amylase. II. Effects of pH, substrate and ions on the activity of the enzyme

Purified human pancreatic alpha-amylase (alpha-1,4-glucan 4-glucano-hydrolase, EC 3.2.1.1) was found to be stable over a wide range of pH values (5.0 to 10.5) with an optimal pH for the enzymatic activity of 7.0. The Michaelis constant of the enzyme at optimal pH and assay conditions was found to be 2.51 mg per ml for soluble starch. Halide ions were required for the activity of the enzyme whereas sulfate and nitrate were not. The order of effectiveness of activation was found to be: Cl- greater than Br- greater than I- greater than F-. Calcium and magnesium were activators at concentrations of 0.001M and 0.005M, respectively, but exhibited inhibitory effects at concentrations higher than 0.005M. At 0.01M ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) concentration the enzymatic activity upon seven min incubation, was inhibited up to 96%. The inhibition of EDTA and calcium could be reversed upon addition of calcium and EDTA, respectively.


Does pH affect Michaelis constant? - biología

Many biologically important molecules have multiple binding sites. For example hemoglobin, the oxygen carrying molecule in red blood cells, binds four molecules of molecular oxygen, each binding at its own distinct binding site. Hemoglobin is an example of a cooperative molecule, that is one where the binding of a ligand at one site alter that the affinity of other binding sites for their ligands. In the case of hemoglobin, the binding of a molecule of O2 at one site aumenta the affinity of the other sites for O2.

This property is critical for the function of hemoglobin, which picks up four molecules of O2 in the oxygen-rich environment of the lungs, then delivers it to the tissues that have a much lower concentration of oxygen. As each molecule of O2bind to hemoglobin, the affinity of the remaining binding site increases, making it easier for more O2 to bind . Conversely, as each molecule of O2 is released to a tissue, the affinity of the remaining sites for O2 decreases, making it easier for subsequent molecules of O2 to dissociate.

Scanning electron micrograph of blood. The doughnut-shaped cells are red blood cells. Photo credit: Bruce Wetzel. Courtesy of the National Cancer Institute.

The problem of how hemoglobin delivers oxygen throughout the body has been studied for the past 100 years. In 1910, biochemist Archibald Hill modeled this property of hemoglobin using the rational function,

dónde &theta is the percentage of binding sites occupied, [L] is the concentration of ligand, norte is the Hill coefficient, which represents the degree of cooperativity, and KD is the dissociation constant. Recall that KD is equal to the ligand concentration when half of the binding sites are filled.

A common application of the Hill equation is modeling cooperative enzymes. These enzymes are under allosteric control, that is the binding of a molecule at one site alters the affinity of the enzyme for its substrate and hence regulates the enzyme activity. In this case, the Hill equation is rewritten as the rational function,

dónde V is the reaction velocity, Vmax is the maximum reaction velocity, and [S] is the substrate concentration. El constante K is analogous to the Michaelis constant (Kmetro) y norte is the Hill coefficient indicating the degree of cooperativity.

Hill coefficient Cooperativity
norte = 1 ninguno
norte & gt 1 positivo
norte < 1 negative

Positive cooperativity occurs when an enzyme has several sites to which a substrate can bind, and the binding of one substrates molecules increases the rate of binding of other substrates. Cooperativity can be recognized by plotting velocity against substrate concentration. An enzyme that displays positive cooperativity sill be sigmoidal (or S-shaped), while noncooperative enzymes display Michaelis-Menten kinetics and the plots are hyperbolic.

Use the Hill equation to answer the following questions:


Ver el vídeo: 9. Théorie de Michaelis-Menten et représentations graphiques (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Munro

    En mi opinión, admites el error. Ofrezco discutirlo. Escríbeme en PM, hablaremos.

  2. Mezaj

    Esta es la preciosa respuesta

  3. Ahmik

    Eliminé este mensaje

  4. Haralambos

    el divertido estado de cosas

  5. Tok

    Tienes un buen blog.



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