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Exocitosis de gránulos secretores de mastocitos

Exocitosis de gránulos secretores de mastocitos


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He estado leyendo un poco sobre la desgranulación de los mastocitos y me he perdido por completo al tratar de comprender cómo se secretan realmente los gránulos secretores.

Entiendo que hay muchas formas en que se puede estimular a los mastocitos para que se desgranulen, pero me he centrado en el ejemplo de la IgE unida a los receptores FcεRI. Creo que tengo razón al decir que la unión de antígenos causa entrecruzamiento de los receptores de FcεRI (dado que los epítopos de antígeno se unen con los paratopos de IgE y los anticuerpos de IgE se unen a los receptores de FcεRI). Esto recluta a Lyn que fosforila los motivos de ITAM en el Cadenas β y γ de los receptores FcεRI. Esto recluta a Syk que está fosforilado y activa LAT. Esto fosforila PLCγ que cataliza la descomposición de PIP2 en IP3 y DAG.

Todo esto conduce a la activación de PKC. Entiendo que PKC es (al menos en parte) responsable de la exoctiosis de SG, pero mi pregunta es ¿por qué medios? Wikipedia, KEGG y este útil recurso son todos muy superficiales, mientras que los artículos académicos que aparece en Google están muy por encima de mi cabeza.

Entonces, si pudiera, ¿qué es lo que hace la PKC y, en general, cómo se transfieren los gránulos secretores desde el interior de la célula a la membrana plasmática y al entorno que la rodea?


Los mastocitos contienen una serie de estructuras granulares grandes que se consideran "lisosomas secretores", pero comparten varias características en común con las vesículas grandes de núcleo denso, en particular con respecto a los mecanismos de exocitosis. Tras la activación, los mastocitos "desgranulan" y exotcitan el contenido de los gránulos.

El mecanismo dependiente de SNARE media la exocitosis de neurotransmisores, hormonas y citocinas. La exocitosis de MCG también depende de SNARE. Las proteínas SNARE son una familia de proteínas conservadas evolutivamente que facilitan el acoplamiento de membranas opuestas y facilitan la fusión de membranas para lograr la exocitosis. El rasgo característico es un motivo SNARE, un tramo de 60-70 aminoácidos, dispuestos en repetición heptada. Esta característica permite que los motivos de SNARE de las proteínas individuales de SNARE (de las membranas opuestas) se cierren juntas, formando un complejo central de un paquete de cuatro hélices. Las principales proteínas SNARE implicadas en la desgranulación de los mastocitos incluyen VAMP-8 (integrada en la membrana de los mastocitos), SNAP-23 y sintaxina-4 (ambas unidas a la membrana plasmática) ⁠. Por supuesto, hay otras capas de regulación. Las proteínas accesorias SNARE sinaptotagmina 2 (un sensor de calcio), Munc13-1 / 2, Munc18-2 y complexin-2, ejercen efectos moduladores negativos o positivos sobre la exocitosis de los gránulos de los mastocitos (Woska y Gillespie 2012).

EDITAR: No sé sobre la participación de PKC, pero puedo especular que es parte de la vía de señalización después de la activación del receptor Fc y corriente arriba de los eventos que inician la movilización de calcio intracelular, que luego desencadenaría inmediatamente la exocitosis. En cuanto al movimiento, si son como vesículas de núcleo denso, se mueven a lo largo de los filamentos de actina utilizando un motor de miosina (Va o Vb, por ejemplo) y en asociación con Rab-3. Sin embargo, esto es una especulación, y sugeriría buscar en la literatura para obtener análisis más detallados, ya que solicita una revisión amplia de la literatura.


Ya ha aprendido mucho más de lo que yo sé sobre las cascadas celulares en los mastocitos, pero quería asegurarme de que conocía este recurso útil: un libro de texto gratuito y de búsqueda "Biología molecular de la célula": http: //www.ncbi .nlm.nih.gov / books / NBK21054 /

Para obtener explicaciones generales sobre biología celular, es completo y legible. Por ejemplo:

Continuar aprendiendo.


Aquí hay un artículo que revisa la acción de la PKC en la exocitosis. Aunque data de hace varios años, debería ser un buen comienzo para acceder a la literatura sobre este tema ya que ha sido citado 90 veces.

Morgan A. et al. (2005) Regulación de la exocitosis por la proteína quinasa C. Biochem Soc Trans. 33:1341-4.

Se sabe desde hace muchos años que la PKC (proteína quinasa C) modula la exocitosis regulada en una amplia variedad de tipos de células. En neuronas y células neuroendocrinas, la PKC regula varias etapas diferentes del proceso exocitótico, lo que sugiere que estas múltiples acciones de la PKC están mediadas por la fosforilación de distintas proteínas dianas. En los últimos años, se han identificado una variedad de proteínas exocitóticas como sustratos de PKC, los mejor caracterizados de los cuales son SNAP-25 (proteína asociada a sinaptosomas de 25 kDa) y Munc18. En el presente estudio, revisamos la evidencia reciente que sugiere que la fosforilación específica del sitio de SNAP-25 y Munc18 por PKC regula distintas etapas de exocitosis.


Habiendo regresado a este tema, encontré este artículo de revista muy útil:

http://journal.frontiersin.org/Journal/10.3389/fimmu.2012.00130/full

Gran parte, me temo, es muy difícil de seguir para mí, pero aún así logré sacar mucho de ella y espero que otros puedan encontrarla útil. Resumiría lo que he encontrado así:

PKC y el aumento de los niveles de Ca2+ se combinan para dirigir la reorganización del citoesqueleto a través de varios intermediarios. El citoesqueleto es como el esqueleto de la célula y también proporciona la estructura a lo largo de la cual los gránulos secretores se mueven hacia la membrana celular. La vesícula se unirá a la pared celular y dispersará su contenido.

He leído sugerencias de que la PKC puede estar involucrada en el proceso de fusión de los gránulos secretores con la membrana celular. Wikipedia sugiere que la PKC participa en la ruptura de los vínculos entre la superficie de los gránulos secretores y el exoesqueleto, lo que le permite fusionarse con la membrana celular.

Obviamente, cualquier corrección es bienvenida.


Ensayos de exocitosis regulada de gránulos de mastocitos

Los mastocitos son efectores importantes en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Contienen numerosos gránulos secretores llenos de mediadores inflamatorios en su citoplasma. La exocitosis del contenido granular no tiene lugar hasta que la célula recibe un estímulo apropiado, como la agregación del anticuerpo IgE unido a los receptores de IgE de alta afinidad por un antígeno específico. Por tanto, este proceso se denomina exocitosis regulada. Una característica de la exocitosis de mastocitos es que no implica la liberación de unos pocos gránulos individuales, sino que una gran fracción del contenido granular se libera debido a la exocitosis compuesta, lo que implica la aparición de gránulos a gránulos y de gránulos a gránulos. fusión de la membrana plasmática. Esta unidad describe ensayos que miden la liberación de contenido granular de los mastocitos. Incluyen ensayos colorimétricos, radiomarcadores o de detección de anticuerpos in vitro para sustancias almacenadas en los gránulos. Dado que los modelos animales para la activación de basófilos y mastocitos se utilizan con una frecuencia cada vez mayor, la unidad también incluye protocolos para medir la exocitosis del contenido de gránulos de mastocitos in vivo.


Ensayos de exocitosis regulada de gránulos de mastocitos

Los mastocitos son efectores importantes en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Contienen numerosos gránulos secretores llenos de mediadores inflamatorios en su citoplasma. La exocitosis del contenido granular no tiene lugar hasta que la célula recibe un estímulo apropiado, como la agregación del anticuerpo IgE unido a los receptores de IgE de alta afinidad por un antígeno específico. Por tanto, este proceso se denomina exocitosis regulada. Una característica de la exocitosis de mastocitos es que no implica la liberación de unos pocos gránulos individuales, sino que una gran fracción del contenido granular se libera debido a la exocitosis compuesta, lo que implica la aparición de gránulos a gránulos y de gránulos a gránulos. fusión de la membrana plasmática. Esta unidad describe ensayos que miden la liberación de contenido granular de los mastocitos. Incluyen ensayos colorimétricos, radiomarcadores o de detección de anticuerpos in vitro para sustancias almacenadas en los gránulos. Dado que los modelos animales para la activación de basófilos y mastocitos se utilizan con una frecuencia cada vez mayor, la unidad también incluye protocolos para medir la exocitosis del contenido de gránulos de mastocitos in vivo.


Materiales y métodos

Anticuerpos.

El clon 69.1 del mAb de sinaptobrevina 2 y el suero de conejo VAMP-8 se obtuvieron de Synaptic Systems. El antisuero de conejo VAMP-3 era de Abcam. El clon 158.2 del mAb VAMP-7 fue un generoso obsequio de Thierry Galli (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, París). Se ha descrito antisuero de conejo que reconoce el terminal carboxilo SNAP-23 (19). El mAb de β-tubulina se obtuvo de Sigma Chemical Co .. Se usó el anticuerpo de catepsina D de cabra C20 (Santa Cruz Biotechnology) para inmunotransferencia, y se usó suero de conejo anti-catepsina D para inmunofluorescencia (un obsequio de Stuart Kornfeld, Universidad de Washington , San Louis). El suero antihistamínico de conejo se obtuvo de Immunostar, Inc. El mAb de rata que reconoce LAMP-2 se obtuvo del Developmental Studies Hybridoma Bank. El mAb anti-serotonina se obtuvo de DAKO. Se obtuvo IgE anti-2,4-dinitrofenil (DNP) (clon TIB-142) de la American Type Culture Collection. Se obtuvieron anticuerpos secundarios conjugados con el colorante Alexa de Molecular Probes.

Ratones y genotipado.

Los ratones Synaptobrevin 2 +/−, sobre un fondo C57BL / 6 (11), eran de Thomas Sudhof (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX). Los ratones VAMP-3 +/−, en un fondo mixto C57BL / 6–129Sv (12), eran del Dr. Jeffery Pessin (Universidad Estatal de Nueva York, Stony Brook, NY). Se obtuvieron ratones VAMP-8 +/−, sobre un fondo mixto C57BL / 6–129Sv, de The Jackson Laboratory. Debido a que los ratones VAMP-8 - / - no se han utilizado en la literatura, la caracterización completa de estos ratones se describe en Texto SI . Para disminuir los efectos de los antecedentes genéticos, todos los ratones se obtuvieron mediante apareamientos de ratones heterocigotos, y se utilizaron controles de camada para todos los experimentos.

Generación de mastocitos.

Se aislaron asépticamente fémures y tibias de ratones VAMP-8 - / - y VAMP-3 - / - de 8 a 12 semanas de edad (y sus compañeros de camada), y se aislaron células de la médula ósea mediante lavados repetidos con medio de mastocitos (RPMI medio 1640, FBS al 20%, l-glutamina 4 mM, β-mercaptoetanol 5x10b5 M, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y antibióticos). Los cultivos se mantuvieron en medio de mastocitos a 37 ° C (5% CO2) en presencia de IL-3 murina (20 ng / ml Peprotech) y factor de células madre murinas (SCF) (20 ng / ml Peprotech), descartándose las células adherentes. Después de 4 semanas, los cultivos fueron & gt90% positivos tanto para c-equipo y FcεRI, según se determina mediante citometría de flujo.

Los mastocitos se generaron a partir de células madre derivadas de bazo e hígado de embriones de 18 días aislados de apareamientos de sinaptobrevina 2 +/-. Las células del bazo y del hígado se cultivaron a 1,0 x 106 por mililitro en medio completo [DMEM que contenía FBS al 20%, l-glutamina 4 mM, β-mercaptoetanol 5 x 10b5 M, medio NCTC 109 al 10% (Sigma Chemical Co. ), Aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM y antibióticos]. El medio se complementó con 50 ng / ml de IL-3 y 50 ng / ml de SCF y las células se cultivaron como se describió anteriormente.

Estimulación de los mastocitos.

La exocitosis de mastocitos se desencadenó mediante el uso de ionomicina 1 µM sola, PMA 10 nM e ionomicina 1 µM juntos, o mediante reticulación de FcεRI como se describió anteriormente (20). Se guardaron alícuotas del sobrenadante del cultivo en los tiempos indicados después de la inducción de exocitosis, y al final del ensayo, las células se lisaron usando Triton X-100 al 1% en medio RPMI 1640. La liberación de β-hexosaminidasa se determinó usando Se midió mediante ELISA un ensayo enzimático (20) de liberación de serotonina (Fitzgerald Industries), histamina (Immunotech) y TNF-α (R & ampD Systems). En algunos experimentos, los mastocitos se incubaron con 1 μCi / ml de [3 H] serotonina (New England Nuclear) durante la noche, se lavaron y se incubaron durante 1 ha 37 ° C antes de inducir su secreción como se indicó anteriormente. La serotonina [3 H] asociada y liberada a células se midió en un contador de centelleo. La catepsina D se ensayó concentrando los sobrenadantes del cultivo utilizando dispositivos de filtro centrífugo Microcon (Millipore de corte de 10 kDa) y analizando los sobrenadantes concentrados y los extractos celulares restantes mediante SDS / PAGE e inmunotransferencia con un suero anti-catepsina D. La cantidad de la forma completamente procesada (43 kDa) de catepsina D madura presente en las células o liberada en el medio se determinó por densitometría. En todos los experimentos, la cantidad de liberación se expresó como un porcentaje de la cantidad total de cada marcador secretado en el medio en comparación con la cantidad total de cada marcador secretado en el medio más la célula restante asociada. La significancia de cualquier diferencia se calculó usando una distribución de una cola en una varianza igual de dos muestras. t prueba.

SDS / PAGE e inmunotransferencia.

El análisis de inmunotransferencia de lisados ​​celulares, sobrenadantes de cultivos concentrados y lisados ​​de células estimuladas se realizó como se describió previamente (9). Las bandas se revelaron con Western Lightening Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences Inc.). La intensidad de las bandas se determinó utilizando un densitómetro de dinámica molecular y se promediaron los resultados obtenidos mediante al menos tres exposiciones de transferencias idénticas. La significancia de cualquier diferencia se calculó usando una distribución de una cola en una varianza igual de dos muestras. t prueba.

Microscopia confocal.

Se dejó que los mastocitos se adhirieran a cubreobjetos recubiertos con poli (l-lisina) y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS. Para el examen de la distribución de histamina, los mastocitos se fijaron usando 40 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida HCl (EDC) (Pierce Biotechnology, Inc.) antes de la adición de PFA (Sigma). A continuación, las células se permeabilizaron en PBS que contenía Nonidet P-40 al 1% / saponina al 0,05% / suero de cabra normal al 3% o saponina al 0,1% / suero de cabra normal al 3% (para catepsina D), teñido con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados, y analizados por microscopía confocal (9). Las imágenes confocales se recolectaron con un microscopio de escaneo láser Zeiss 510 META con una lente Plan-Apochromat × 100 (N.A. 1.4), 100 nm por píxel xy muestreo, y un diámetro de agujero de alfiler establecido para proporcionar un grosor de corte óptico de 1,0 μm. Imagen z-Las pilas se recogieron a través de la profundidad de la celda utilizando un tamaño de paso de 0,4 μm. El grado de colocalización de dos etiquetas se midió utilizando el módulo de Colocalización de Imaris 4.2.0 (Bitplane AG), como se describe en Texto SI .


RESULTADOS

El péptido E inhibe la exocitosis estimulada en células PC12 permeabilizadas

Recientemente, demostramos que el péptido E sintético correspondiente a una porción del segmento corto que mira al citoplasma que une el segundo y tercer tramo transmembrana de SCAMP2 es un inhibidor potente y específico de secuencia de la exocitosis en mastocitos permeabilizados (Guo et al., 2002). La asociación aparentemente única del segmento peptídico con SCAMP y la colocalización de SCAMP con proteínas SNARE seleccionadas en la superficie de los mastocitos sugirió un posible papel de SCAMP2 en la fusión de membranas exocitóticas. Sin embargo, la incapacidad para transfectar y cultivar fácilmente mastocitos altamente diferenciados fue un obstáculo para probar la función SCAMP2 de manera más directa. Para complementar estas observaciones y superar las limitaciones del enfoque experimental, examinamos si el péptido E inhibía la secreción regulada en células PC12 neuroendocrinas, en las que sería posible la expresión de SCAMP mutantes. Las células PC12 se marcaron con [35 S] sulfato y se probó la descarga de secretogranina marcada con 35 S de vesículas grandes de núcleo denso después de la permeabilización con SLO, el equilibrio con el péptido y la estimulación con Ca 2+ 10 µM tamponado. Como se muestra en la Figura 1, el péptido E de SCAMP2 (CWYRPIYKAFR) inhibió fuertemente la secreción. Por el contrario, el péptido correspondiente de SCAMP1 (G reemplazando a K8 L6 reemplazando yo6) y dos variantes estructurales del péptido SCAMP2 E (A que reemplaza a C1 AA reemplazando a W2Y3) tuvo poco o ningún efecto inhibitorio. Las autorradiografías incluidas en la Figura 1A ilustran el efecto y también muestran que la secreción no estimulada no se ve afectada por ninguno de los péptidos. La inhibición semimáxima por el péptido SCAMP2 E se produjo a ~ 15 µM (Figura 1B). Por tanto, la especificidad de la secuencia y la potencia de inhibición son las mismas que en los mastocitos (Guo et al., 2002).

Fig. 1. El péptido E inhibe la liberación estimulada de secretogranina marcada con 35S a partir de células PC12 permeabilizadas. Las células en placas de 24 pocillos se marcaron durante la noche con [35 S] sulfato, se persiguieron y se permeabilizaron con SLO. Luego se equilibraron durante 30 min en hielo con o sin (control) Ca 2+ tamponado con EGTA (10 µM) y con o sin péptido E. La secreción de SG marcada con 35 S se evaluó como en MATERIALES Y MÉTODOS. (A) Los péptidos E de SCAMP2 normal, SCAMP1 normal y variantes estructurales de SCAMP2 en los que los residuos 1, 2 y 3 juntos se cambiaron de C a A y WY a AA, respectivamente, se compararon a una concentración de 100 μM. La secreción estimulada de secretogranina marcada con 35 S osciló entre el 35 y el 45% del total por encima de una secreción no estimulada del 1-2% del total. El recuadro presenta una autorradiografía de muestra que demuestra claramente los efectos del péptido sobre la secreción. (B) Curva dosis-respuesta para la inhibición de la secreción por el péptido E de SCAMP2. Los resultados mostrados están normalizados para la secreción estimulada de muestras sin péptido de tres experimentos independientes y se representan como media ± SEM.

Distribución de SCAMP 1 y 2 en celdas PC12

Realizamos una serie de estudios para examinar la localización de SCAMPs 1 y 2 en células PC12 con particular interés en la medida en que la distribución de SCAMP2 reiteró o difirió de la caracterizada en otros tipos de células, especialmente mastocitos (Guo et al., 2002). Por inmunofluorescencia, tanto los SCAMP 1 como 2 se observan en focos a lo largo del citoplasma y se extienden hasta los bordes de las células, de acuerdo con una localización primaria en endosomas y otros orgánulos de reciclaje. Sin embargo, la distribución de secretogranin II (SG), un marcador de grandes vesículas de núcleo denso, fue muy distinta (Figura 2, A y B). Esta observación planteó inmediatamente la cuestión de si los dos SCAMP son componentes importantes de las membranas granulares. En particular, en puntos ocasionales cerca de la periferia celular, los patrones de tinción SG y SCAMP2 fueron similares, y su superposición en una imagen combinada parecía probable (Figura 2B). Para abordar la presencia o ausencia de SCAMP 1 y 2 en los gránulos de forma más directa, purificamos los gránulos mediante fraccionamiento subcelular y comparamos las distribuciones de SCAMP y SG a través de las fracciones de gradiente mediante transferencia Western. Como se muestra en la Figura 2C, SCAMPs 1 y 2 (y también 3) se concentraron juntos en fracciones de baja densidad, con cantidades insignificantes codistribuyendo con SG. Por lo tanto, sorprendentemente y en contraste con los mastocitos y otros tipos de células secretoras reguladas que hemos examinado anteriormente (Brand et al., 1991 Guo et al., 2002 nuestras observaciones no publicadas), los SCAMP 1 y 2 no parecen ser componentes significativos de las membranas granulares secretoras en las células PC12.

Fig. 2. Localización de SCAMP 1 y 2 en células PC12. (A y B) Imágenes de inmunofluorescencia de doble marca que muestran las distribuciones de los dos SCAMP (teñidos con anticuerpos 1ω y 2τ y anticuerpo secundario etiquetado con Alexa 488) en comparación con secretogranina (SG teñido con anti-SG biotinilado y avidina-Alexa 594). En cada caso se muestra una sección deconvolucionada digitalmente (0,2 μm) que incluye un perfil nuclear sin teñir. Barra, 10 μm. (C) Distribución de SCAMP en comparación con secretogranin en grandes vesículas de núcleo denso purificadas por centrifugación en gradiente. Las gráficas de SG y SC2 son perfiles de intensidad de bandas de transferencias Western probadas con anti-SG y anti-SC2 (2τ), detectadas con un anticuerpo secundario marcado con 125I y analizadas mediante imágenes de fósforo. Las transferencias de Western que lo acompañan muestran la distribución de SG y de SCAMPs 1-3 según lo detectado por mAb 7C12 y quimioluminiscencia mejorada. (D) Distribuciones de SCAMP2 y SG como se observa en láminas de membrana plasmática (Lang et al., 2001) usando inmunofluorescencia de doble marca (anticuerpos como en B). La barra corresponde a 5 μm. (E) Imágenes microscópicas de electrones teñidas con inmunogold que muestran focos SCAMP2 marcados de forma múltiple (puntas de flecha abiertas) en membranas plasmáticas arrancadas de la superficie celular superior. Se utilizó el anticuerpo primario 2τ. El cuarto panel, marcado C, es un control negativo que muestra una partícula de oro solitaria ocasional cuando se omitió la tinción del anticuerpo primario. * identifica una barra de pozo recubierta de clatrina, 0,2 μm.

La ausencia de cantidades significativas de SCAMP2 en grandes vesículas de núcleo denso, sin embargo, su aparente superposición con SG en la periferia celular sugirió una posible colocalización con gránulos acoplados. Para examinar esta posibilidad con una interferencia mínima de los orgánulos intracelulares que contienen SCAMP, preparamos láminas de membrana plasmática mediante sonicación ligera de células cultivadas en cubreobjetos recubiertos de polilisina y las marcamos doblemente con anticuerpos contra SCAMP2 y SG. Como se ve en las micrografías de fluorescencia en la Figura 2D, SCAMP2 estaba de hecho presente en toda la superficie en pequeños focos, y la mayoría de la tinción SG, que marca vesículas grandes de núcleo denso asociadas con las hojas, se superpone significativamente a la tinción SCAMP. Para confirmar que la población de SCAMP2 observada en las membranas plasmáticas estaba de hecho en la superficie celular, llevamos a cabo un marcaje inmunológico con oro en láminas de membranas plasmáticas preparadas adhiriendo rejillas de microscopio electrónico recubiertas de polilisina a la superficie celular superior y arrancándolas del resto de la membrana plasmática. celda. Como se ve en la Figura 2E, las partículas de oro inmunológico que representan SCAMP2 aparecieron en múltiples grupos discretos dentro de la superficie, que casi siempre estaban restringidos a parches que se tiñeron más intensamente en las imágenes. En unos pocos casos, visualizamos superficies en las que parecía haberse conservado la unión de vesículas de gran núcleo denso, y había partículas de oro cerca de los sitios de unión (Figura 2E). No pudimos discernir si SCAMP2 se concentró directamente debajo de los gránulos. Cuando se omitió el anticuerpo anti-SCAMP2 primario, el etiquetado de las superficies de la membrana fue insignificante y apareció principalmente en forma de partículas de oro solitarias ocasionales (Figura 2E, control).

La superposición de SCAMP2 y SG en las láminas de la membrana plasmática y la aparente asociación con los sitios de unión de los gránulos (Figura 2D) parecía recordar la asociación de grandes vesículas de núcleo denso con focos de sintaxina1 en los sitios de exocitosis en las membranas plasmáticas de las células PC12 (Langet al., 2001). En consecuencia, nos preguntamos hasta qué punto SCAMP2 podría localizarse en posibles sitios de acoplamiento / fusión. Para examinar esta posibilidad, llevamos a cabo un marcado triple en las láminas de membrana plasmática preparadas mediante sonicación utilizando anti-SCAMP2 de conejo, anti-sintaxina1 monoclonal de ratón y un anticuerpo de conejo biotinilado contra SG. Los resultados se muestran en la Figura 3. La comparación de los patrones de marcado individuales y la superposición tricolor muestra que hay una colocalización significativa de SCAMP2 con vesículas de núcleo denso grandes y sintaxina1. Debido a que las intensidades de los tres colores generalmente no coincidían para dar manchas blancas, cuantificamos las distribuciones de los focos SCAMP2 y SG (Figura 3, E y F). Sorprendentemente, el 70% de SCAMP2 se colocalizó con SG o con SG junto con sintaxina1, mientras que el 85% de SG se localizó con SCAMP2 solo o junto con sintaxina1. Estos hallazgos sugieren fuertemente que SCAMP2 está presente en sitios en los que grandes vesículas de núcleo denso se acoplan en la membrana plasmática y especialmente en sitios en los que es probable que estos gránulos experimenten una fusión mediada por sintaxina1. Hemos confirmado la asociación de vesículas de núcleo denso grande que contienen SG con focos SCAMP en las membranas plasmáticas usando marcaje doble con mAb anti-SG y anti-SCAMP 7C12 (datos no mostrados).

Fig. 3. (A – F) Comparación de las distribuciones de SCAMP2, sintaxina1 y secretogranina mediante triple inmunotinción de láminas de membrana plasmática preparadas según Lang et al.(2001). (A – C) Imágenes individuales de una hoja teñida con anticuerpo secundario marcado con anti-SCAMP2 (2τ) / Alexa 488 (A), azul anti-SG biotinilado / avidina-pacífico (B) y anti-sintaxina 1 (mAb HPC1 ) / Anticuerpo secundario marcado con Alexa 594 (C). (D) Imagen fusionada de A – C. Las puntas de flecha abiertas identifican varios ejemplos de SCAMP2 superpuesto SG pero no la sintaxina 1, y las puntas de flecha rellenas identifican SCAMP2, SG y sintaxina superpuestos 1. (E y F) Comparación cuantitativa de las distribuciones de SCAMP2 (E) y SG (F) con respecto a los otros antígenos marcados obtenidos a partir de recuentos de cinco láminas de membranas plasmáticas distintas a la que se muestra en la figura. D: barra, 5 micras.

Colocalización de complexina con SCAMP2

Para evaluar aún más la proximidad de la porción de la membrana plasmática de SCAMP2 a la maquinaria de fusión de la exocitosis regulada, comparamos las distribuciones de SCAMP2 y complexina. La mayoría de los estudios de complexina se han centrado en su papel en la exocitosis de vesículas sinápticas, en las que se une y estabiliza los complejos SNARE sinápticos para apoyar el evento de fusión final (Pabst et al., 2000 Reim et al., 2001 Tokumaru et al., 2001 Chenet al., 2002). Debido a que las mismas SNARE actúan en la exocitosis de vesículas de núcleo denso grande en células PC12 (Chen et al., 1999 Lang et al., 2001), asumimos que la complexina podría tener un papel análogo en la fusión rápida de gránulos y se concentraría en los sitios de fusión. Como se muestra en la Figura 4, A – C, la complexina se colocaliza ampliamente con SCAMP2 en las membranas plasmáticas de las células PC12. La cuantificación de los focos inmunoteñidos en tres láminas de membranas diferentes indicó que la complexina y SCAMP2 se superpusieron completamente (o casi) en el 85% de los focos y exhibieron una tinción estrechamente opuesta en el 5% de los focos, con un 8 y 2% de los focos que mostraron tinción para SCAMP2 y complexina sola, respectivamente. Estos resultados apoyan firmemente la opinión de que SCAMP2 se colocaliza con maquinaria de fusión de la superficie celular.

Fig. 4. Comparación de la distribución de SCAMP2 con complexina y con el receptor de transferrina (TfR) en láminas de membrana plasmática por inmunofluorescencia de doble marca. En la parte superior se muestran imágenes de una hoja teñida con anticuerpo secundario (A) marcado con anti-SCAMP2 (2τ) / Alexa 488, anticuerpo secundario marcado con mAb anti-complexina / Alexa 594 (B) y una imagen combinada (C) , y las imágenes de una hoja teñida con anticuerpo secundario marcado con anti-SCAMP2 (2τ) / Alexa 488 (D), anticuerpo secundario marcado con anti-TfR mAb / Alexa 594 (E) y una imagen combinada (F) se muestran debajo . C: barra, 5 micras.

Como control de la especificidad de las colocalizaciones observadas en las láminas de la membrana plasmática, comparamos la distribución de SCAMP2 con el receptor de transferrina. La Figura 4, D – F, muestra que hay poca superposición de SCAMP y tinción del receptor. También se compararon las distribuciones de SCAMP2 y la proteína Thy1 anclada a GPI, pero como ya se mostró para la tinción comparativa de sintaxina1-Thy1 (Lang et al., 2001), la abundante tinción difusa de Thy1 no se concentró con SCAMP2 (nuestras observaciones no publicadas).

Sobreexpresión de versiones normales y mutadas de SCAMP2 de longitud completa en células PC12

Habiendo establecido que el péptido E de SCAMP2 bloquea la liberación de vesículas de núcleo denso grande y que una porción de SCAMP2 se concentra en sitios prospectivos de fusión / acoplamiento de gránulos, abordamos el papel de SCAMP2 en la exocitosis mediante la sobreexpresión de mutantes del polipéptido de longitud completa. Presumimos que si el péptido E fuera parte del dominio funcional de SCAMP, la sobreexpresión de SCAMP2 disfuncional mutado en el péptido E, pero no SCAMP2 normal, inhibiría la exocitosis regulada mediante la unión competitiva a otros componentes esenciales de la maquinaria exocitótica. Utilizando células PC12 reguladas por tetraciclina (Tet-off), comparamos los efectos de dos mutaciones dentro del segmento del péptido E de SCAMP2 de longitud completa etiquetada con N-myc con los efectos de la normal etiquetada con N-myc (tipo salvaje) SCAMP2 y de transfección simulada con el vector pTRE2 vacío. Las dos mutaciones fueron C → A (mutante A) y W → A (mutante B) dentro del segmento del péptido E (ver MATERIALES Y MÉTODOS). En cada caso, las células se cotransfectaron con ADNc que codifica hGH y la hormona expresada se usó para ensayar la secreción en las células transfectadas. Después de la transfección, se añadió dox en diferentes momentos para generar una variedad de niveles de sobreexpresión (en relación con SCAMP2 endógeno) y se continuó la incubación hasta 72 h. En dos experimentos independientes en los que se administró dox a las 48 h, la microscopía de inmunofluorescencia mostró que el 12% de las células totales se transfectaron con cada SCAMP marcado con myc. De las células que expresan myc-SCAMP, el 40-50% también expresó hGH, y aproximadamente el 20% de las células transfectadas expresaron hGH sola. Para abordar las localizaciones de proteínas expresadas, comparamos la distribución de cada SCAMP2 etiquetado con myc a SG (Figura 5). En general, el SCAMP2 exógeno (normal o mutante) exhibe una distribución que es bastante similar a lo que se observa para el SCAMP2 endógeno en células no transfectadas (Figura 2B). La envoltura nuclear / retículo endoplásmico rugoso no está teñido, lo que indica que los SCAMP exógenos pasaron el control de calidad. Además, ninguno de los SCAMP exógenos afectó la distribución de SG. Las vesículas grandes de núcleo denso se acumulan debajo de la membrana plasmática y la sobreexpresión no condujo a un aumento de la pérdida de estos gránulos por los SCAMP. Esto último también fue cierto cuando las vesículas de núcleo denso se descargaron por despolarización antes de la transfección para acelerar el recambio de gránulos (nuestras observaciones no publicadas).

Fig. 5. Expresión y localización de SCAMP2 marcado con myc en células PC12 reguladas por Tet. Se añadió Dox a las 48 h después de la transfección y las células se marcaron doblemente con anticuerpo anti-myc de ratón y anti-secretogranina. Se prepararon imágenes desconvolucionadas a partir de cinco células de cada tipo que expresaban SCAMP2 de tipo salvaje, mutante A (C → A) o mutante B (W → A). Se muestran secciones ópticas representativas (0,2 μm) que incluyen perfiles de núcleos. Barra, 10 μm.

Inhibición dependiente de la dosis de la exocitosis inducida por despolarización en células PC12 por SCAMP2 mutante

Los efectos de diferentes niveles de expresión de SCAMP2 exógenos sobre la secreción se presentan en la Figura 6. En experimentos preliminares, agregamos dox en diferentes momentos después de la transfección para validar que se logró la expresión regulada de cada SCAMP2 exógeno (Figura 6A) y para seleccionar puntos de tiempo eso proporcionaría niveles comparables de expresión de cada construcción. Luego llevamos a cabo varios experimentos independientes en cada uno de los cuales se transfectaron muestras de células replicadas en paralelo con ADN que codificaban SCAMP2 de tipo salvaje, mutantes A (C → A) y B (W → A), o vector pTRE2 vacío y en todos los casos con ADN que codifica hGH. Para cada muestra, los niveles de SCAMP2 marcado con myc endógeno y exógeno se cuantificaron mediante transferencia Western, y se cuantificó mediante ELISA la secreción de hGH, inicialmente en medio bajo en K + y posteriormente en medio alto en K +. Como se muestra en la Figura 6B, la expresión de SCAMP2 de tipo salvaje marcado con myc a niveles hasta 50 veces más altos que los de SCAMP2 endógeno tuvo muy poco efecto sobre la secreción estimulada por K + alta en comparación con las células transfectadas con pTRE2 vacío. Por el contrario, los mutantes A y B mostraron una clara inhibición dependiente de la dosis de la secreción regulada que alcanzó una extensión máxima del 70%. En el caso del mutante A, la inhibición fue aparente con una sobreexpresión de 30 veces y fue casi máxima con una sobreexpresión de 50 veces (en base a la comparación con los datos de sobreexpresión de 120 veces no mostrados). El mutante B fue mucho más potente, mostrando una inhibición detectable en una sobreexpresión de 1,6 veces y una inhibición casi máxima en una sobreexpresión de cinco veces o más.

Fig. 6. Expresión regulada por Tet de SCAMP2 marcado con myc y sus mutantes en células PC12 e inhibición dependiente de la dosis de la secreción de hGH inducida por despolarización. (A) Transferencias de Western con anticuerpo anti-myc 9E10 que ilustran el cambio en la expresión de SCAMP exógeno (mutante A utilizado como ejemplo) cuando se añade dox en momentos especificados después de la transfección. (B) Gráfico de la secreción de hGH (porcentaje del total) estimulada por despolarización (●, ▴, ▾) o no estimulada (○) en función del nivel de expresión (LOE) de SCAMP2 exógeno en relación con SCAMP2 endógeno. La secreción de hGH se determinó mediante ELISA. La transfección simulada (vector pTRE) se muestra a cero LOE con 42% de secreción de hGH (32% neto estimulado). Los datos se compilan a partir de ocho experimentos de transfección independientes. Las barras de error indican el rango obtenido cuando los experimentos independientes dieron como resultado el mismo LOE en relación con los endógenos. (C) Evolución temporal de la secreción de hGH inducida por despolarización por células PC12 que habían sido transfectadas con vector pTRE2, SCAMP2 de tipo salvaje, mutante A o mutante B. Muestras de células PC12 reguladas por tet cotransfectadas por duplicado con ADNc que codifica hGH y El vector pTRE2 vacío (simulado), SCAMP2 de tipo salvaje (wt), mutante (mut) A o mutante B se trataron con 2 µg / ml de dox en momentos que lograron niveles comparables de expresión. A las 72 h después de la transfección, las muestras se utilizaron para analizar la tasa de secreción a intervalos de 2 minutos. Se añadió medio con alto contenido de K + a los 0 minutos para iniciar la despolarización. (D) La adición de LPC al medio supera sustancialmente la inhibición de la secreción causada por la sobreexpresión de los mutantes A y B de SCAMP2. los mutantes B se trataron con 2 µg / ml de dox en momentos en los que se alcanzaron niveles de expresión comparables. A las 72 h después de la transfección, las muestras se incubaron 10 min en medio bajo en K + y luego 10 min en medio alto en K + en ausencia o presencia de LPC 15 μM, y los medios y los lisados ​​celulares se analizaron para determinar la hGH mediante ELISA. y expresado como porcentaje del total. Los resultados son de cinco experimentos independientes. Para la secreción no estimulada de hGH (derecha), los resultados para el mutante A se representan como ejemplo. Para SCAMP2 de tipo salvaje, los resultados son idénticos para el mutante B, la secreción no estimulada de hGH es 14,5 y 12% para LPC 0 y 15 μM, respectivamente. Las barras de error indican la media ± SEM. (E) La sobreexpresión del mutante B inhibe la secreción de hGH estimulada por una combinación de ionóforo de calcio A23187 y dibutirato de forbol. Se cotransfectaron muestras de células PC12 reguladas por tet con ADNc que codifica hGH y SCAMP2 de tipo salvaje o mutante B y se indujeron exactamente como en D. Las muestras duplicadas en tres experimentos independientes se incubaron durante 10 minutos en medio bajo en K + (con o sin dimetilsulfóxido, el solvente para A23187 y los datos de dibutirato de forbol con dimetilsulfóxido mostrado) y luego 10 min en un medio bajo en K + con 0.5 μM de A23187 y 0.1 μM de dibutirato de forbol (PDBu) o medio alto en K +. Se analizaron los medios y los lisados ​​celulares para determinar la hGH y los resultados se expresan como en D. La secreción no estimulada de hGH fue del 12 al 15% del total en todos los casos.

Para comprobar si la inhibición de la secreción por los mutantes de SCAMP2 estuvo acompañada de un cambio en la cinética de la secreción, comparamos los cursos de tiempo de la descarga de hGH en respuesta a la despolarización de K + durante un período de 10 minutos. Como se muestra en la Figura 6C, la inhibición por cualquiera de los mutantes ocurrió directamente, sin ningún cambio en la tasa de secreción.

Finalmente, para evaluar si la inhibición de la secreción por sobreexpresión de mutantes A y B podría reflejar una interferencia con eventos moleculares de exocitosis que se manifiestan en la membrana plasmática, probamos si la adición de LPC al medio rescataría la liberación de hGH impulsada por la despolarización. LPC, un lípido en forma de cono invertido, ha sido identificado como un fusógeno transbicapa en sistemas modelo (Chernomordik et al., 1998), y su adición a la levadura que expresa SNARE geranilgeraniladas fue capaz de superar parcialmente un bloqueo tardío en la exocitosis (Groteet al., 2000). Inicialmente, realizamos una titulación y establecimos que las concentraciones de LPC & lt20 μM no tenían ningún efecto sobre la secreción de hGH de las células no estimuladas. Posteriormente, se realizaron cinco experimentos separados utilizando LPC 15 μM, un nivel similar al utilizado anteriormente para perturbar la exocitosis en células de mamíferos (Chernomordiket al., 1993), para comprobar su efecto sobre la secreción estimulada y no estimulada. Como se esperaba, LPC no tuvo ningún efecto sobre la secreción no estimulada (bajo-K + medio Figura 6D, derecha). Además, la LPC no tuvo ningún efecto sobre la secreción de hGH estimulada por K + por las células transfectadas con pTRE2 o SCAMP2 de tipo salvaje marcado con myc. Sin embargo, el tratamiento revirtió la inhibición causada por la sobreexpresión del mutante A en un 75% y del mutante B en un 65% (Figura 6D, izquierda). El nivel de restauración supera al obtenido en levadura (Grote et al., 2000).

El mutante B de SCAMP2 también bloquea la exocitosis estimulada por ionóforo de calcio y éster de forbol

La exocitosis de grandes vesículas de núcleo denso en las células PC12 en respuesta a la despolarización requiere la entrada de calcio extracelular a través de los canales de la membrana plasmática (p. Ej., Taylor y Peers, 1999). Por tanto, es posible que SCAMP mutante sobreexpresado pueda bloquear la exocitosis indirectamente al interferir con el suministro de calcio y que la adición de LPC invierta la inhibición a este nivel en lugar de más distalmente. Para evaluar esta posibilidad, pasamos por alto la entrada de calcio impulsada por la despolarización y usamos el ionóforo de calcio A23187 y el éster de forbol (dibutirato de forbol) para elevar el calcio intracelular y estimular la secreción. Comparamos la descarga de hGH de células que expresan SCAMP2 de tipo salvaje y mutante B a niveles comparables a los usados ​​en la Figura 6D. Como se muestra en la Figura 6E, la secreción estimulada por ionóforo y éster de forbol en células que expresan SCAMP2 de tipo salvaje fue ligeramente más robusta que la secreción estimulada por despolarización. Sin embargo, la expresión del mutante B inhibió la secreción por ambos tipos de estímulos en la misma medida. Por tanto, la inhibición de la secreción estimulada por ionóforo / éster de forbol por el mutante B argumenta que su perturbación es posterior al suministro de calcio.

Efectos de SCAMP2 exógeno sobre la endocitosis

Debido a que los SCAMP se concentran en las membranas de la vía endocítica (Brand y Castle, 1993 Wu y Castle, 1998), otra forma en la que los SCAMP exógenos pueden alterar la exocitosis indirectamente es perturbando el tráfico de proteínas de membrana que forman parte de la maquinaria exocítica durante la endocitosis. y reciclaje. De hecho, se demostró anteriormente que la sobreexpresión transitoria robusta de SCAMP1 disminuye la captación de transferrina en las células Cos (Fernandez-Chacon et al., 2000). Para comprobar si podría ocurrir una perturbación similar después de la sobreexpresión de SCAMP2 regulada por tet en células PC12, examinamos la endocitosis de transferrina marcada con fluorescencia en células que expresan niveles comparables (sobreexpresión de aproximadamente cinco veces) de SCAMP2 de tipo salvaje y mutante B (Figura 7). Encontramos que ni las formas de tipo salvaje ni mutante de SCAMP2 bloquearon la endocitosis por completo, sin embargo, ambas parecieron disminuir la captación y la concentración de transferrina en los endosomas de reciclaje, y el mutante B mostró un efecto más fuerte que el de tipo salvaje. En particular, el nivel del efecto inhibidor parecía ser variable de una célula a otra, probablemente reflejando diferencias en el nivel de expresión de SCAMP2 exógeno, pero las variaciones fueron generalmente limitadas en el sentido de que cayeron dentro del rango de variación en la absorción de transferrina por los no transfectados. celdas (ver Figura 7, B y F). Por lo tanto, nuestros resultados indican que la expresión de SCAMP2 exógena potencialmente podría tener efectos indirectos y negativos sobre la exocitosis. Sin embargo, sospechamos que es poco probable que tales efectos sean una fuente importante de la perturbación que hemos observado, por dos razones. Primero, el tráfico endocítico solo se ralentiza y no se inhibe por completo. En segundo lugar, los niveles de t-SNARE asociados a la membrana plasmática, sintaxina 1 y SNAP25 no se alteran notablemente al expresar SCAMP2 exógeno, especialmente el mutante B (Figura 8).

Fig. 7. Efectos de SCAMP2 sobreexpresado sobre la endocitosis de transferrina. Las células PC12 se transfectaron con SCAMP2 de tipo salvaje (A – D) o B mutante (E – H), cada una etiquetada con myc, utilizando las mismas condiciones que en la Figura 6, C – E. Después de la incubación durante 5 min a 37 ° C con transferrina (Tf) marcada con Alexa 594, las células se fijaron y se inmunoteñieron con anticuerpo secundario marcado con anti-myc y Alexa 488. Se muestran imágenes de espesor completo, lo que permite la comparación visual de la extensión de la absorción y concentración de Tf por células transfectadas y no transfectadas. Aunque la captación está algo reducida en las células transfectadas con respecto a las vecinas no transfectadas, el rango del efecto inhibidor es difícil de distinguir del rango en la captación por las células no transfectadas (por ejemplo, las células marcadas con flechas en B y F). Abajo a la derecha: barra, 10 μm.

Fig. 8. La sobreexpresión de SCAMP2, en particular el mutante B, no afecta de forma notable a la distribución de SNARE de la membrana plasmática, sintaxina 1 y SNAP25. Las células PC12 transfectadas con el mutante B marcado con myc en las mismas condiciones que en la Figura 6, C-E, se examinaron mediante inmunofluorescencia de doble marcaje a nivel de célula completa y como láminas de membrana plasmática preparadas mediante sonicación ligera. Se muestran imágenes representativas de láminas de membrana plasmática teñidas con anticuerpos contra el epítopo myc más sintaxina 1 y el epítopo myc más SNAP-25 e ilustran las distribuciones similares y parcialmente superpuestas de SCAMP2 con las SNARE. Abajo a la derecha: barra, 5 μm.


Discusión

La familia Rho de pequeñas proteínas de unión a GTP desempeña funciones reguladoras críticas en una variedad de procesos celulares, incluida la organización citoesquelética, la motilidad celular, la señalización transcripcional y la progresión del ciclo celular (para una revisión, ver Hall 1998). En este estudio, hemos implicado a Cdc42 y / o Rac en una nueva función biológica para señalar la desgranulación de vesículas secretoras en células RBL-2H3. Al expresar mutantes dominantes-activos y dominantes-negativos usando virus vaccinia, hemos demostrado que Cdc42 y Rac actúan temprano en esta vía de señalización activando IP3 producción y el consiguiente aumento del calcio intracelular tras la estimulación del antígeno. También se construyeron vectores de expresión viral para un tercer miembro de la familia Rho, RhoA. Sin embargo, la infección de las células HeLa con RhoA dominante activo indujo eventos celulares dramáticos, como una morfología celular deformada y una localización anormal de actina. Dado que estos fenotipos eran indicativos de comportamiento y fisiología celular aberrantes, interrumpimos el estudio adicional de RhoA en el contexto de la desgranulación en células RBL-2H3.

Se había propuesto un papel para las pequeñas GTPasas, Cdc42, Rac y Rho, en la exocitosis basándose en trabajos anteriores en los que la adición de GTPasas recombinantes activadas mejoraba la desgranulación en células permeabilizadas (Norman et al. 1994 Price et al. 1995 Brown et al. 1995 Brown et al. al. 1998). La mayoría de estos estudios habían supuesto que las GTPasas estimulaban la desgranulación al inducir principalmente los reordenamientos citoesqueléticos de actina que normalmente acompañan a la secreción. La actina filamentosa se despolimeriza en la región cortical por debajo de la membrana plasmática y se repolimeriza en el interior de la célula tras la estimulación del antígeno (Koffer et al. 1990 Norman et al. 1994). Se cree que esta redistribución es necesaria para aliviar el impedimento estérico en la periferia celular, permitiendo que los gránulos secretores accedan a la membrana plasmática para la fusión y liberación de su contenido (Lelkes et al. 1986). Además, se ha demostrado que Rac y Rho recombinantes mejoran la secreción en mastocitos permeabilizados que habían sido estimulados con GTPγS en presencia de calcio alto, lo que sugiere que las Rho GTPasas también realizan funciones aún desconocidas en etapas posteriores de la vía de señalización siguiendo la paso de entrada de calcio (Norman et al. 1996). Nuestra observación de que la expresión de Cdc42 o Rac de tipo salvaje no parecía inhibir la señalización del calcio sugirió la posibilidad de que los efectos inhibidores producidos durante la secreción estimulada por antígenos puedan manifestarse después de la activación de la vía de entrada de calcio. Aunque no está claro por qué Cdc42 o Rac de tipo salvaje producen un efecto inhibidor sobre la secreción, especulamos que la sobreexpresión de estas proteínas, a través de la competencia con las formas activadas de la proteína de unión a GTP, aparentemente puede formar un complejo no productivo con un efector diana que es importante para la secreción y, por lo tanto, inhibe esta respuesta de señalización. Finalmente, nuestra demostración de que Cdc42 y Rac estimulan la PI3 La formación y la señalización de calcio tras la estimulación antigénica nos lleva a favorecer un modelo en el que las GTPasas juegan un papel en al menos tres procesos que pueden influir en la desgranulación: (a) estimulación de la señalización de calcio y activación de PKC (Fig.9, ayb ), (b) cambios citoesqueléticos de actina (Fig. 9 c), y (c) una función no identificada posterior a la entrada de calcio (Fig. 9 d).

Hasta ahora, no hemos podido detectar efectos mediados por Rho GTPasa en eventos aguas arriba de IP3 producción en la vía de señalización. La estimulación antigénica induce la activación de muchas proteínas de señalización mediante eventos de fosforilación de tirosina en células RBL-2H3 (Li et al. 1992). La expresión de Cdc42 negativo dominante no alteró significativamente el patrón de fosforilación potenciada en lisados ​​de células RBL-2H3 estimuladas en transferencias Western probadas con anticuerpo anti-fosfotirosina (datos no mostrados). En células de riñón de mono COS7 y células de fibroblastos de ratón NIH-3T3 infectadas con Cdc42 negativo dominante, el PLCγ1 inmunoprecipitado se fosforiló en la misma medida que las células infectadas con el vector vacío, lo que indica que el Cdc42 negativo dominante no interfirió con los eventos que condujeron a la fosforilación. de PLCγ1 en estos tipos de células (datos no mostrados).

Además, no creemos que sea probable que los cambios citoesqueléticos inducidos por la infección viral causen un efecto dramático en la vía de señalización que conduce a la desgranulación, ya que las células que fueron infectadas con el vector vacío todavía exhibieron un fuerte nivel de secreción en respuesta a la estimulación del antígeno. Sin embargo, los cambios citoesqueléticos producidos por la infección viral pueden ser uno de los factores que contribuyeron a la modesta disminución de la eficacia de la secreción tras la infección con el vector de control en comparación con las células no infectadas. Hemos intentado observar la consecuencia de la infección por vaccinia en la reorganización citoesquelética inducida por FcεRI mediante la tinción de células con faloidina y la realización de inmunofluorescencia. Desafortunadamente, la infección viral indujo un redondeo de las células durante el curso de la infección, lo que hizo más difícil distinguir la estructura fina de los elementos citoesqueléticos.

Sospechamos que los cambios observados en IP3 La formación y la señalización del calcio no son simplemente fenotipos secundarios inducidos por los efectos de Cdc42 y Rac sobre la remodelación de actina. El tratamiento de las células con el éster de forbol, PMA, indujo cambios citoesqueléticos similares a los resultantes de la incubación tanto con PMA como con el ionóforo de calcio A23187. Sin embargo, la combinación de PMA y A23187 estimuló fuertemente la desgranulación, mientras que PMA solo no lo hizo, lo que indica que el reordenamiento citoesquelético es insuficiente para inducir la vía de señalización que conduce a la secreción (Ludowyke et al. 1994). Además, nuestros estudios de unión in vitro que identifican una interacción entre Cdc42 y PLCγ1 sugieren que Cdc42 se alimenta directamente en el IP3/ vía de señalización del calcio.

PLCγ hidroliza PIP2-4,5 para formar los dos segundos mensajeros, IP3, que se une a la IP3 receptor en la membrana del RE para liberar las reservas internas de calcio y 1,2-diacilglicerol, que estimula la actividad de la PKC. Por lo tanto, la activación de PLCγ es fundamental para iniciar una cascada de señalización en una amplia variedad de tipos de células que responde a las interacciones receptor-ligando en la superficie celular. Se han identificado tres familias principales de PLC: β, γ y δ (para una revisión, véase Rhee y Bae 1997). La estimulación de PLCβ y PLCγ está vinculada a receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas y tirosina quinasas, respectivamente, mientras que el papel de la activación de PLCδ por los receptores de la superficie celular sigue sin estar claro. PLCβ2 se ha caracterizado como un objetivo para Cdc42 y Rac en un estudio que describe el aislamiento de un complejo entre Cdc42 y LyGDI, que se encontró que medía la activación dependiente de GTP de PLCβ2 in vitro (Illenberger et al. 1998). Rac, pero no Rho, también fue capaz de estimular la actividad de PLCβ2. Esta activación se observó además en un sistema compuesto por proteínas recombinantes purificadas, lo que sugiere que la interacción entre Cdc42 / Rac y PLCβ2 fue directa. La activación de Cdc42 / Rac de PLCβ2 parecía ser muy específica ya que las GTPasas no podían mejorar la actividad de PLCδ1 o una segunda isoforma de PLCβ, PLCβ1 (Illenberger et al. 1997).

Originalmente nos habíamos centrado en PLCγ1 como un posible objetivo para las Rho GTPasas en la estimulación de la IP3/ vía del calcio basado en el trabajo que examina la activación de PLCβ2 mediada por Cdc42 / Rac. Hemos establecido una interacción in vitro entre GST-Cdc42 recombinante purificada y una proteína de lisados ​​de células RBL-2H3 que coincidía estrechamente con la masa molecular esperada (∼145 kD) de PLCγ1 y fue reconocida por un anticuerpo policlonal generado contra los aminoácidos 1249– 1262 en el extremo COOH de PLCγ1, pero migró ligeramente más rápido que la mayoría de PLCγ1 purificado de células de insecto. El PLCγ1 purificado contenía un componente de proteína que comigraba con la proteína de interacción de los lisados ​​de células RBL-2H3 y se unía a GST-Cdc42 de una manera dependiente de GTP. Esto sugiere que puede ser una forma modificada de PLCγ1 que se une de manera más efectiva a Cdc42 activado, y quizás da como resultado una función reguladora especializada que vincula a Cdc42 con eventos de señalización que conducen a la secreción. Intentamos determinar si el pequeño aumento en la movilidad observado para las especies inmunorreactivas de PLC que se une a Cdc42 puede haber sido causado por hipofosforilación de PLCγ1. Tanto en las células NIH-3T3 en reposo como en las células epidermoides humanas A431, se ha demostrado que PLCγ1 en su estado basal contiene fosfoserina (Meisenhelder et al. 1989). Por tanto, parecía posible que un porcentaje del PLCγ1 total purificado expresado en células de insecto pudiera contener menos grupos fosfato en los residuos de serina y, por tanto, explicar la movilidad más rápida en los geles de proteínas. Sin embargo, el tratamiento de PLCγ1 purificado o inmunoprecipitado con fosfatasa ácida de patata para eliminar los grupos fosfato susceptibles no produjo una proteína de masa molecular más baja (datos no mostrados). Hay una serie de otras posibilidades para las interacciones Cdc42 / PLCγ1 que quedan por abordar. Por ejemplo, es posible que la asociación entre Cdc42 activado y un PLCγ1 no modificado sea transitoria, ya que hasta ahora no hemos podido detectar un complejo in vivo estable entre PLCγ1 y Cdc42 usando métodos de coinmunoprecipitación.

Además de posiblemente regular PLCγ1 directamente y remodelar la arquitectura citoesquelética, las Rho GTPasas también pueden modular las actividades de otras moléculas de señalización que juegan un papel en el desencadenamiento de la desgranulación. Algunos candidatos potenciales pertenecen a la familia de las lípido quinasas, que genera productos lipídicos que realizan tareas clave de señalización después de la estimulación antigénica. Primero, fosfoinositido 3-quinasa (PI3-K) fosforila PIP2-4,5 para formar fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3-3,4,5), que puede inducir la translocación de PLCγ1 a la membrana plasmática mediante interacciones con su homología pleckstrin y dominios SH2 (Bae et al. 1998 Falasca et al. 1998). Dado que se ha demostrado que Cdc42 y Rac estimulan la PI3-K de una manera dependiente de GTP (Zheng et al. 1994 Tolias et al. 1995), las GTPasas pueden estar ejerciendo su influencia sobre PLCγ1 indirectamente estimulando PI3-K para generar niveles más altos de PIP3-3,4,5. Además, el tratamiento de las células RBL-2H3 con el PI3-El inhibidor de K, wortmanina, atenuó la respuesta secretora, lo que sugiere que el PI3La actividad -K es esencial para que se produzca la desgranulación (Yano et al. 1993). En segundo lugar, las actividades combinadas de la fosfatidilinositol fosfato 4-quinasa (PIP4-K) y fosfoinositido 4,5-quinasa (PI5-K) generar PIP2-4,5, el lípido diana que es escindido por PLCγ1 (para revisión, ver Toker 1998). Tanto Rac como Rho han sido implicados en la activación de estas lípido quinasas para aumentar la producción de PIP.2-4,5 (Chong et al. 1994 Hartwig et al. 1995), que posteriormente puede regular positivamente la vía de señalización que conduce a la desgranulación al proporcionar más sustrato para PLCγ1. Finalmente, se ha demostrado que la actividad esfingosina quinasa moviliza calcio tras la estimulación del antígeno (Choi et al. 1996), lo que sugiere que pueden activarse múltiples señales para elevar los niveles intracelulares de calcio. La implicación de los lípidos de esfingosina en la mediación de la señalización del calcio los identifica como posibles dianas para la regulación por las Rho GTPasas.

En resumen, ahora presentamos hallazgos que resaltan un papel importante para la Cdc42 y / o Rac GTPasa en la mediación de los cambios de calcio que son críticos para la exocitosis de los gránulos secretores. Estos eventos regulatorios ocurren en un paso inmediatamente anterior a la liberación de calcio de las tiendas y parecen tener un impacto en la propiedad intelectual.3 producción y en la interacción entre este segundo mensajero y la agregación de su receptor ER / canales de calcio. La capacidad de Cdc42 y / o Rac activados para unirse a PLCγ1 puede ser la base de un paso clave en lo que probablemente sea una regulación compleja de la señalización de calcio a través de la unión de antígenos y la activación resultante de Rho GTPasas. Los esfuerzos futuros se dirigirán a comprender mejor la base mecanicista por la cual Cdc42 y Rac influyen en los cambios de calcio y si otros aspectos de la secreción mediada por antígenos también se ven afectados por estas GTPasas.


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El mastocito: donde se encuentran la endocitosis y la exocitosis regulada

Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Escuela de Medicina Sackler, Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel.

Ronit Sagi-Eisenberg Departamento de Biología Celular y del Desarrollo Escuela de Medicina Sackler Universidad de Tel Aviv Tel Aviv 69978 Israel Tel .: 972-3-640-9500 Fax: 972-3-640-7432 Correo electrónico: [email protected] Buscar para más artículos de este autor

Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Escuela de Medicina Sackler, Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel.

Ronit Sagi-Eisenberg Departamento de Biología Celular y del Desarrollo Escuela de Medicina Sackler Universidad de Tel Aviv Tel Aviv 69978 Israel Tel .: 972-3-640-9500 Fax: 972-3-640-7432 Correo electrónico: [email protected] Buscar para más artículos de este autor

Abstracto

Resumen: Hemos investigado si las proteínas de unión a Ca 2+, que se han implicado en el control de las neuronas y la secreción neuroendocrina, desempeñan un papel en el control de la función de los mastocitos. Estos estudios han identificado las sinaptotagminas (Syts) II, III y IX, así como el sensor 1 de Ca 2+ neuronal (NCS-1) como importantes reguladores de la función de los mastocitos. Sorprendentemente, encontramos que estas proteínas de unión a Ca 2+ contribuyen a la función de los mastocitos regulando vías endocíticas específicas. Syt II, el homólogo de Syt más abundante en mastocitos, reside en un compartimento lisosómico libre de aminas. El estudio de la función de las células de leucemia basófila de rata derribadas por Syt II ha demostrado una función dual de este homólogo. Se requiere Syt II para la regulación a la baja de la proteína quinasa Cα, pero regula negativamente la exocitosis lisosomal. Syt III, el siguiente homólogo más abundante, se localiza en endosomas tempranos y es necesario para la formación del compartimento de reciclaje endocítico (ERC). Syt IX y NCS-1 se localizan en el ERC y regulan la exportación de ERC, NCS-1 activando la fosfatidilinositol 4-quinasa β. Finalmente, mostramos que el reciclaje a través del ERC es necesario para la clasificación de proteínas de los gránulos secretores, así como para la activación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos, quinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares. En consecuencia, NCS-1 estimula la exocitosis desencadenada por FcɛRI y liberación de metabolitos del ácido araquidónico.


Onderzoekt mestcel secretiegranula Biosynthese van exocitosa

El protocolo de doel van het huidige fue un método de análisis genómico funcional de van mestcel secretie zal ontwikkelen. El protocolo está gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en análisis en tiempo real van de morfologie van de secretoire korrel & # 39s.

Abstracto

Mestcellen (MC) zijn secretoire cellen van het immuunsysteem die de fysiologische en pathologische functies vervullen door het vrijgeven van voorgevormde en nieuw gesynthetiseerde allergische, ontstekings- en immuunregulerende mediatoren. MCs & # 39mediators beïnvloeden meerdere weefsels en organen culminerend in allergische en immuunreacties. De Synthese, opslag en afgifte van de MC mediators zijn sterk gereguleerd. De voorgevormde bemiddelaars zijn verpakt in cytoplasmatische secretoire korrels (SG) die fuseren met de plasmamembraan en de inhoud ervan vrij te maken door gereguleerde exocytose. Presentamos un protocolo basado en la coexpresión de un gen van belang conocido como un reportergen dat is gericht op de SG y opgenomen in een reguleerbare wijze naast de endógene SG mediators. Het protocol maakt hoge resolutie vierdimensionale confocale análisis van de MC SG & # 39s y het toezicht op hun tijdlijn van biogenese naar aanleiding exocitosa. Dus, protocolo de identificación de puerta para detección de interés genético hun fenotypische en functionele efecto maakt ontcijferen moleculaire mecanismen die de biogenese en exoctose MC SG bepalen e identificeren van de betrokken regulatoren. Daarbij moet verder inzicht in de cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor MCs functie in gezondheid en ziekte worden.

Introducción

Mestcellen (MC) zijn immuuncellen die bekend staan ​​om hun betrokkenheid bij allergische en ontstekingsreacties zoals artritis, astma, eosinofiele oesofagitis, chronische dermatitis en anafylactische shock 1,2 en andere aandoeningen zoals coronate 3,5 hartziek. Daarnaast MCs spelen een belangrijke rol in aangeboren en adaptieve immuniteit, zowel in de afweer tegen bacteriën en parasieten en door onderdrukking van immuunreacties, bijvoorbeeld het induceren allotransplantaat tolerantie 5,6.

MCs afkomstig uit het beenmerg, het ontwikkelen van CD34 + / CD117 + pluripotente voorlopercellen 7. Geëngageerde beenmerg MC voorouders vrijkomen in de bloedbaan en migreren naar de perifere weefsels lokaliseren voornameithejkiteinvitar bindli en el epígrafe de enrutamiento real en el mundo real. citocinas binnen het omringende milieu 8,9.

MC kan worden geactiveerd door een allergeen (antigen, Ag), waarvan de ontmoeting resulteerde in de generatie van immunoglobuline E (IgE) type antilichamen. Enlace van dergelijke IgE aan de MC & # 39s FcsRI receptorren, gevolgd door verknoping van celgebonden IgE bij hernieuwde blootstelling aan hetzelfde Ag, leidt FceRI aggregatie en initiatie van een signalerende cascade die culmineert in degranulatie [herzien 10,11]. MCs worden ze geactiveerd, onafhankelijk van IgE door neuropeptiden 5,12, toxinas 13 bacteriële en virale antigenen 14,15, een aantal positief geladen peptiden gezamenlijk aangeduid als base- secretagogen, immullen en cytokines 5,13,12,16 17. MCs worden ze geactiveerd door veel van hun bezit mediatoren, die de ontstekingsreactie verder versterken.

MC & # 39s zijn verpakt con secretoire korrels (SGS) dat immuno bevattenregulerende mediatoren, zoals vasoactieve aminen, zoals histamine en serotonine (bij knaagdieren), proteoglycanen, proteasen, zoals quimasa en triptasa, vasculaire enifactor endotelial 8 groilines. Deze mediatoren & quotklaar voor & quot en eenmaal MCs worden geactiveerd door een geschikte stimulus, worden deze mediatoren vrijgemaakt uit de cellen door gereguleerde exocitosa (degranulatie) en een kwestie van seconden tot minuten 18,19. Deze initiële gebeurtenis wordt gevolgd puerta Delaware Delaware novo Synthese en afgifte van een grote apesta van biologisch potente stoffen, zoals arachidonzuur metabolieten, verschillende cytokinen en chemokinen 20,21,22. Release van nieuw gesynthetiseerde producten gebeurt onafhankelijk van SG release. Tezamen zijn deze bemiddelaars initiëren vroege en late fase inflamatoire en allergische reacties. Daarom es su mayor importancia.

De moeilijkheid om genetisch te manipuleren primaire en gekweekte MCs heeft bemoeilijkt de pogingen om de mechanismen die diez grondslag liggen MC degranulatie, die slecht bleef opgelost te helderen. Om dit probleem ontwikkelden we een reporter gebaseerde test met gelijktijdig transfecteren van de mucosale mast cellijn, rat basofiele leukemie (RBL) -2H3 (hierna RBL) of beenmerg afgeleide MCs (BMMCs) 30 met een gen van interesse en neuropéptido Y (NPd) aan monómero RFP (mRFP), también SG reporter.

NPY es eerder aangetoond dat het gedrag van endogene SG merkers in andere systemen recapituleren. Bovendien, omdat mRFP fluorescentie pH ongevoelig expressie van NPY-mRFP maakt visualisatie van de zure SG y kwantitatieve beoordeling van exocytose door 96 pocillos platina en een fluorescentie plaatlezer. We hebben aangetoond dat NPY-mRFP wordt geleverd aan de zure SG van RBL-cellen en BMMCs en wordt vrijgemaakt uit de cellenop een gereguleerde manier naast de endogene SG lading (dat wil zeggen, β-hexosaminidasa en serotonina) 30, 32. Dit protocol voorziet in een hoge-resolutie-imagegebaseerde methodologie die screening genen van belang zijn voor hun fenotypische in functionele impact op SG kenmerken en degranulatie in RBL cellen 32 toestaat. Especifiek, dit protocol maakt real time tracking van MC SG en kwantificering van de oppervlakte en het volume groot, aantal, kinetiek van assembly, hun beweging langs de cel cytoskelet en hun uiteindelijke fusie met de plasmamembraan onder verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld, sensibiliserende de cellen met DNP-specifieke IgE en het activeren van de cellen met een meerwaardige Ag (DNP geconjugeerd serumalbumine) onder verschillende verstoringen (dwz, het uitschakelen van genen van belang, meer dan de expressie van wt of gemuteerde genen, of farmacologische manipulaties) en vergeleken met controle cellen.

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Protocolo

1. Medios de cultivo celular Voorbereiding van de RBL

    Meng 500 ml de glucosa van laag Dulbecco & # 39s gemodificeerd Eagle & # 39s medium (DMEM) met 56 ml foetaal runderserum (dit maakt 10% FBS) en voeg 5,5 ml peniciline streptomycine (dit maakt

    Groeien RBL cellen en una furgoneta atmosférica vochtige 5% CO2 bij 37 ° C en la platina ofwel de kolven. RBL-cellen die groeien en platina de 10 cm worden aangevuld met 10 ml medium en vormen confluente monolaag van

  1. Verwijder het kweekmedium van de plaat / kolf met behulp van een steriele Pasteur pipet verbonden vacuüm.
  2. Spoel de cel monolaag met voorverwarmd (37 ° C) 0,25% de tripsina / EDTA dat de gehele monolaag (het volume afhankelijk van de grootte van kweekplaat / fles bedekt, 2 ml de placa de 10 cm). Dit zal de cellen los.
  3. Als alternatief, spoel de cel monolaag met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), verwijder de PBS en voeg voorverwarmde (37 ° C) tripsina / EDTA. Deze stap los de cellen sneller.
  4. Plaats de plaat / kolf en una incubadora a 37 ° C (niet meer dan 10 min).
  5. Inspecteer de cellen onder de optische microscoop te kijken of ze hebben losgemaakt. Als de cellen niet los na 10 min, tik zachtjes op de plaat / kolf.
  6. Medio In de kweekplaat / kolf aan de cellen schorten (het volume van de drager dient ten minste 2-voudig groter dan het volume van de tripsine-oplossing).
  7. Puerta de pellet de cellen centrifugatie gedurende 3 min bij 200 g bij 25 ° C.
  8. Resuspendeer de cellen en medio. Verdun de cellen door 01:10 en zaad in een nieuwe cultuur schotel. Incubeer de cellen gedurende 48-72 uur, totdat zij reach ongeveer 90% confluentie.
  9. Procedimiento de Herhaal dezelfde (párrafo 2.2.1-2.2.8) tot 3 maanden (30 pasajes).

3. Bereiding van transfectie media.

  1. Bereid een oplossing van 100 mM K-buizen pH 7, 1 mM oplossing van Ca2 + acetaat y 100 mM oplossing van Mg2 + acetaat.
  2. Verdun de oplossing van 100 mM K-Pipes pH 7 a 20 mM met DMEM media, voeg 1 mM oplossing van Ca 2+ acetaat para una eindconcentratie van 10 uM en 100 mM oplossing van Mg2 + acetaat para eindconcentratie van 2 mM.
  3. Weeg Kalium glutamaat en aan de oplossing tot een eindconcentratie van 128 mM, meng en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Houd de resterende oplossingen (bijv. K-buizen, Ca2 + acetaat, Mg2 + acetaat) bij -20 ° C.

4. Transfectie van cellen RBL

  1. Verwijder het kweekmedium van de plaat / kolf met eensteriel pasteurpipet verbonden vacuüm.
  2. Spoel de cel monolaag met voorverwarmde (37 ° C) tripsina / EDTA dat de gehele monolaag bestrijkt. Plaats de plaat / kolf en una incubadora a 37 ° C (niet meer dan 10 min). Controlador de de cellen losgemaakt met de optische microscoop.
  3. Medio In de kweekplaat / kolf aan de cellen schorten (het volume van de media moeten minstens 2 groter dan het volume van de tripsine-oplossing).
  4. Tel het aantal cellen met behulp van hemocytometer.
  5. Pellet 1,5 x 10 7 cellen door centrifugatie gedurende 3 min bij 200 xg bij 25 ° C. Verwijder het sobrenadants en voeg 280 pl transfectiemedium. Breng de reactie mengsel en cubeta de 4 mm.
  6. Voeg 20 ug NPY-mRFP plasmide en hetzij 30 ug controle lege plasmide de een geteste plasmide. Het eindvolume van het reactiemengsel moet 300 pi.
  7. Direct te plaatsen op ijs gedurende 10 min. Veeg de cuvette van restwater y proceden elektroporatie bij 300 V 9 mseg.
  8. Voor metingen van exocytose, replate de cellen directo en 24 well weefselkweek gerechten die 300 ul medium. Voeg 8 ul van het reactiemengsel (4 x 10 5 cellen) aan elk putje. Voeg 4 x 10 5 niet getransfecteerde cellen extra putjes controle. Bereid voldoende putjes om ten minste in duplo putjes voor elke behandeling voor elke transfectie.
  9. Para microscopios de lapso de tiempo, reemplace de cellen directamente en un sistema de cubreobjetos de borosilicato Kamer de 8 pocillos con 80 ul de medio. Voeg 1,5 ul van het reactiemengsel (7,5 x 10 4 cellen) aan elke kamer. (Probeer te voorkomen dat het gebruik van de kamers aan de rand van het dekglaasje, de kamers in het centrum van het dekglaasje zijn gemakkelijker te afbeelding).
    OPMERKING: Belangrijk es, niet alle cellen reactie op een trekker en zo nu en dan de time-lapse microscopie wordt ingetrokken als gevolg van het verlies van focus en drift van het 8-well kamer borosikunst op dekglaasje systemem. Daarom bereiden tenminste 8 kamers voor elke behandeling voor elke transfectie.
  10. Voor sensibiliseren de cellen voor FcsRI gemedieerde activering, voeg 1 ug / ml muizen monoklonale DNP IgE aan de media (Incubeer de cellen met IgE gedurende tenminste 2 uur).
  11. Na 18-24 uur gebruik een fluorescentiemicroscoop te bevestigen dat de cellen brengen de plasmiden. De excitatie en emissie golflengtes van mRFP fluorescentie zijn: Aex 584, Aem 607 nm. NPY-mRFP moeten verschijnen in vesiculaire structuren die overreenkomen met de SGS. Als het tweede gen van interesse gefuseerd aan een fluorescerend tag een fluorescentiemicroscoop op de co-expressie van beide plasmiden te bevestigen aan dezelfde cellen. Bijvoorbeeld, wanneer de te testen gen gefuseerd aan GFP, de excitatie en emissie golflengtes van GFP fluorescentie zijn: A ex 488, Aem 507 nm. De GFP-gelabeld eiwit zou moeten verschijnen op dezelfde cellen die NPY-mRFP uiten.
  12. Para exocitosa metingen overgaan para stap 5 en voor microscopia de lapso de tiempo, ga verder met stap 6.

5. Exocitosa Het meten van NPY-mRFP

  1. Amortiguador Voorbereiding van Tyrode:
    1. Bereid una furgoneta de cierre de 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl en 8 mM NaH 2PO 4 en DDW. Meng goed bewaren bij 4 ° C. Deze stap está voor de bereiding van 20x Tyrode buffer.
    2. Bereid een van oplossing van 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, glucosa 5,6 mM en 1 a 20 verdunning van Tyrode 20x en DDW en meng. Deze stap es voor de voorbereiding van 1x tampón Tyrode.
    3. Aliquot de 1x Tyrode buffer en bewaar bij -20 ° C. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.
    1. Stel de autofluorescentie van niet-getransfecteerde RBL cellen als blanco. Verdeel de AFU van elk sobrenadante aan de totale fluorescentie (AFU van de bovenstaande vloeistoffen + AFU van de bijbehorende lysaat) en vermenigvuldig cumpl 100.

    6. Microscopio de lapso de tiempo van Exocytose

    1. Semilla 7.5 × 10 4 van de getransfecteerde cellen / kamer en un sistema kamer borosilicaat dekglaasje de 8 pocillos. Na 18-24 uur, verwijder het kweekmedium uit de kamers en was 3 maal met Tyrode buffer
    2. Voeg 72 ul van Tyrode buffer aan elke kamer. Verdun de activerende reagentia Tyrode buffer 10x concentratie. & ltli & gt Gebruik een confocale fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verhitte kamer (37 ° C) en CO2 controlador (4,8%) en een 40x de 63x objetiv. Zet de microscoop systemen: kwiklamp, computer, en láseres. Zorg ervoor dat de verwarmde kamer es op de juiste temperature voor het starten van het experiment.
    3. Plaats de kamer in de verwarmde ruimte en zorg ervoor dat de kamer goed en stabiel is geïnstalleerd.
    4. Zet de fluorescentie licht volgens de relevante fluorofoor en visualiseren getransfecteerde cellen. Schakel fluorescentie eens een cel van belang está en het veld in om te bleken en cytotoxiciteit te minimaliseren. Het is belangrijk dat dit veld over 2-3 getransfecteerde cellen bevatten. De getransfecteerde cellen moet goed gespreid maar elkaar niet raken.
    5. Pas het laservermogen (afhankelijk van de microscoop) om ruis en oververzadiging en toxiciteit te minimaliseren, en stel de versterking en offset de signaal-ruisverhouding te atten. Escanee snel in ofder de duur van laser expositie (gemiddeld 2) te verminderen.
    6. Pas de pinhole grootte een maximum, dit maakt het bichos van de laservermogen en afbeeldingen gerichte langere periode te handhaven. Indien gewenst, stelt u de parameters voor de Z-stack om het beeld te reconstrueren in de dryimensionale, pas de pinhole grootte tot 1 luchtig eenheid (AU), die de beste signaal-ruisverhouding geeft en het verwerven van de openvolgende scannen van twee- dimensionale confocale optische schijfjes en de z -ejes optische plakjes ≤0,7 urn.
    7. Stel het interval tussen elke verkrijging 15-30 sec en de duur van de totale adquisitie tot 15 min, en begint aan afbeeldingen. Na 5 min van verwerving pauzeren de tijdreeks. Voeg 8 ul van de 10x trekker over en onmiddellijk verder met de overname.
    8. Sla de foto & # 39s, het uitvoeren deconvolutie met behulp van een deconvolutie software y reconstrueren de stapels tot drie dimensionale beelden en een film met Imaris software.
    1. Importeren de gegevens van deconvoluted tijdreeksen beelden die werden verkregen door de confocale fluorescentie microscoop software Imaris. Software deze menos más dan 40 microscopie bestanden. Als de software niet kan lezen van de bestanden de bestanden converteren naar TIF-bestanden en import.
    2. Om tijd punten toe te voegen aan het einde van een open data set druk op Bewerken - & gt Add Time Points en de set importeren nieuwe gegevens.
    3. Maak het oppervlak van de mRFP kanaal con behulp van de optie oppervlak wizard. Kies de standaard algoritmo. Kies het kanaal van NPY-mRFP. Markeer de optie smoothing om ruis te verminderen. Om verlies te voorkomen van kleine detalles te verminderen het gebied detailniveau tot 0,05 micrómetros.
    4. Stel de intensiteit drempel. Nieuwe grijze oppervlak zal worden weergegeven. Ga naar & # 39Instellingen & # 39 en schakel de stijl van & quotMiddelpunt & quot tot & quotSurface & quot.
    5. Ga naar het tabblad statistiek in de eigenschappen van het geselecteerde object, selecteert u de gedetailleerde tabblad en de specifieke waarde tales fluorescentie-intensiteit, volumen, etc.
    6. Bekijk de gegevens en bevestigen dat de waarden zijn compatibel met de beelden. Bijvoorbeeld kunnen twee de meer aangrenzende korrels worden gemeten als een grotere korrel. Voor het kwantificeren van de gemiddelde korrelgrootte verdelen de grootte van de gefuseerde gránulos het werkelijke aantal korrels.
    7. De gewenste gegevens naar Excel-bestanden te exporteren en analyseren van de gegevens.

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    Resultados representativos

    Vanwege de lage transfectie effiëntie van MC, genetische manipulaties waarschijnlijk geen invloed op uitlezingen van gemiddeld secretie gemeten puerta mediadores endógenos SG verlaten. Niettemin, door het instellen volledige co-expressie van het reportergen NPY-mRFP en de gecotransfecteerde plasmide in dezelfde cellen, controle van NPY-mRFP resultaten bewaken uitsluitend de celpopulatie die het gen van belang tot expressie brengt. Daarom es het voordeel van deze ensayo diez opzichte van conventionele werkwijzen es het vermogen om genetisch gemanipuleerde cellen (Figura 1) selectief controleren.

    Inderdaad, met behulp van deze test hebben genen die vesiculaire handel, waaronder oplosbare NSF [N-ethylmaleimide gevoelige fusie] gehechtheid eiwit receptor (kleine) eiwitten en 44 leden van de Rab GTPasen familie reguleren gescreend. Geïdentificeerde genen die SGsize, aantal, lading samenstelling en exocitose 23 reguleren.

    Geïdentificeerd 30 Rabs die gewijzigd (bijvoorbeeld remmen of bevorderen) exocitose in RBL-cellen gestimuleerd door hetzij Ag of de combinatie van een Ca2 + ionofoor en de forbolester TPA (Ion / TPA) 23. Confocale beeldvorming onthulde SNAREs en Rabs die dramatische fenotypes veranderen van de morfologie SG 30,32 veroorzaakt. Confocale beeldvorming van deze eiwitten onthulde 8 SNARE en Rabs dat dramatische fenotypes op de cellen of de SG morfologie 30,32 veroorzaakt. Cumplió con el protocolo de van dit waren nosotros in staat om individuele SGs volgen en metingen van hun grootte, fluorescentie-intensiteit, hun beweging y exocytose voeren. Zo hebben we geïdentificeerd Rab5 als regulator van SG biogenese 30. Rab5 es geïdentificeerd als een meester regulator van endocytose en endosomaal fusion 24. We hebben aangetoond dat co-expressie van constitutief negatieve (CN) GDP vergrendeld mutanten van het express endogeen (Rab5A, Rab5B y Rab5C) de eXpression van Rab5A / B / C dirigidos a shRNAs, verminderde de SG & # 39s & # 39grootte met een gelijktijdige toename van hun aantal op 30. Omgekeerd expressie van een GTP vergrendeld, constitutief-actieve (CA) mutante (Rab5A Q79L, hierin & quotCA Rab5A & quot), waarvan bekend is dat homotypische fusie van vroege endosomen (EE) 24 vergemakkelijken, resulteerde in de vorming van reusachtige -Rab5A ingericht blaasjes, die we van vandenterd de als base de SG secretoire cargando NPY-mRFP en serotonina, en hun vermogen om exocitosa en een gereguleerde manier 30.

    Figura 2 análisis morphometrische toont van de NPY-mRFP bevattende SGS. De gemiddelde SG volumen CA-Rab5A expressie brengen tot de waarde van 44 urn 3, die & gt 20-voudig groter dan het gemiddelde van de SG in de controle-GFP tot expressie brengende cellen, terwijl het aantal was verlaagd cumpl 20-voudig (Figura 2A). De inverse relatietussen het aantal en de grootte van de SG & # 39s (Figura 2A) suggereerde dat de Rab5 gemedieerde uitbreiding van de SG & # 39s impliceert hun homotypische fusie.De reus NPY-mRFP bevattende SG gevormd door CA Rab5A laat confocale microscopie beeldvorming van levende cellen in een hoge-resolutie die maakt het monitoren van de SGS detalles die anders niet mogelijk zouden zijn. Zo hebben we ontdekt Rab5A in het fuseren van SG & # 39s naast kleinere structuren verspreid over de reus SGS, het meest waarschijnlijk overeenkomt met endosomen (Figura 2B). Daarnaast hebben we aangetoond dat Rab5 tijdelijk en liefst associeert reunió a nieuw gevormde SG suggereert dat de selectieve en tijdelijke associatie van Rab5A con nieuw gevormde SG es compatible con een fusogenisch que enriquecen el fusible de diferentes tipos de SG.

    Figuur 3 toont vertegenwoordiger time-lapse beelden van MC gigantische SG & # 39s die werden gevormd door expressie van CARab5A en de kinetiek van exoctose in de resolutie van een enkele SG na stimulatie. Tijdens MC exocitosa, de SG & # 39s te verplaatsen naar en samensmelten met de plasmamembraan. Bijgevolg secretorische lading vrijkomt uit de cellen in de extracellulaire ruimte. En deze experimentantele systemem es NPY-mRFP vrijgemaakt uit de cellen en in de cellen supernatanten. De fluorescentie van NPY-mRFP in de cel supernatanten kan worden gemeten met een fluorescentie lezer. Omdat NPY-mRFP in de supernatanten verdund zijn fluorescentiesignaal kan niet worden gedetecteerd of gevisualiseerd door fluorescentie microscopie. De afgifte van NPY-mRFP van de granules gedurende exocitosis heeft een snelle en dramatische afname in NPY-mRFP fluorescentie-intensiteit en krimp van de NPY-mRFP bevattende SG en hun desaparerance. fluorescentie-intensiteit de NPY-mRFP se encontró con SG grootte nauwkeurige beoordeling van de kinetiek van exocytose vanindividuele korrels. Figuur 3B toont de fluorescentie-intensiteiten van SG na stimuleren van de cellen met Ca2 + ionofoor. De SG exocitose ondergaan op verschillende tijdstippen (bijvoorbeeld 2, 3, 6, en 11 min na stimulatie), terwijl de fluorescentie-intensiteit van een SG die niet fuseren met de plasmamembraan constante bleef.


    Figura 1 :. Illustratie van de belangrijkste stappen van het protocol RBL cellen gecotransfecteerd reunió NPY-mRFP en un tweede gen van interesse de overreenkomstige controle plasmide en direct gezaaid op dekglaasjes, 8 putjes kamer borosilicaat dekglaasje system of 96-well platen. De volgende dag, Beelden van de NPY-mRFP bevattende SGs in rust- en getriggerd cellen worden overgenomen door confocale microscopie (A). Daarnaast exocitose van restinG en veroorzaakt cellsis gekwantificeerd door meting van de afgifte van NPY-mRFP en een plaat met 96 putjes fluorescentielezer (B).


    Figura 2 :. Kwantificering van de SGS grootte RBL-cellen werden gecotransfecteerd met NPY-mRFP en hetzij GFP de GFP-CA Rab5A en gezaaid op 8 putjes kamer borosilicaat dekglaasje systemem. 24 uur más tarde werd de 8 putjes kamer geplaatst laser confocale microscoop uitgerust verhitte kamer (37 ° C). Z-stack beelden van opeenvolgende beelden met optische schijfjes 0,7 micrómetros werden gevangen met behulp van een 63X olie / 1.4 numerieke apertura doelstelling. De beelden werden gedeconvolueerd en dryimensionale beelden werden geconstrueerd door het Imaris software. Het volume van de SG en hen werden berekend met de Imaris software (A). Een deel van de NPY-mRFP bevattende Granules lijkt te worden ingebed in Rab5A (pijlpunten). Anderen zijn naakt de overbrugd se encontró con Rab5A (pijlen). Barra de Schaal = 5 micrómetros (B). Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.


    Figura 3 :. Het meten van de omvang en de kinetiek van exocytose in de resolutie van een enkele SG in activadaRBL cellen RBL-cellen werden gecotransfecteerd met NPY-mRFP en GFP-CA Rab5A en geënt IN8-goed kamer borosilicaat dekglaasje systemem. 24 uur después werd IN8 putjes kamer en un microscopio de confocalización láser uitgerust se encontró con un verhitte kamer (37 ° C) en de cellen werden geactiveerd con 10 uM Ca2 + ionofoor. Beelden werden elke 15 segundos reunidos 63x olie / 1,4 numerieke apertuur doelstelling verkregen. Afbeeldingenwerden gedeconvolueerd en vervolgens verwerkt door de Imaris software. Barra Schaal = 5 urn (A). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de NPY-mRFP bevattende granules werd bepaald door het Imaris software en de gegevens werden genormaliseerd naar tijd 0 (tijdstip van toevoeging van de Ca2 + ionofoor). De pijlen geven de tijdstippen waarop release van SGcargo wasnoted (B). Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

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    Discusión

    Hemos creado una estrategia innovadora para la obtención de exocitos de MC de exocitos en vier (x, y, z, t) y una combinación de deseos de crecimiento de tijd vervallen dryimensionale beeldvorming van de SG en Levende Cellen reunidos con otros reporteros de exocitosis. Deze techniek maakt het screenen van Families van eiwitten voor hun impact op de MC-functie, zoals monitoreando SG & # 39s al vanaf hun vertrek uit het Golgi door hun rijping, adquisitie van exocytose competeteie en degranulatie. De combinatie van metingen van exocitose met morfometrische en kinetische karakteristieken van de SG verschaft inzichten in de mechanismen die de geteste eiwitten bemiddelen functies MC. Daarom es het gebruik van deze methodiek, genetische manipulatie van gerichte genen kunnen nieuwe moleculaire mechanismen die door de MC SG & # 39s winkel en laat hun lading onthullen. Opmerkelijk NPY kan dienen als een reporter voor exoctose andere secretoire cellen zoals MCF-7 cellen, een cellijn afgeleid from menselijke borstklier adenocarcinoom 31, chromaffinecellen 34 en pancreatische β-cellen 35.

    Genetische manipulaties zijn de meest krachtige tools die momenteel beschikbaar zijn voor het onderzoeken van functionele netwerken. Genetische manipulatie kan de identificatie van essentiële eiwitten in elk netwerk, waarvan verwijdering zal ineenstorting van het system te handhaven, in tegenstelling tot andere eiwitten waarvan deletie zal overspraak tussen paralelle netwerken dwingen of geen effect door redundantie. Vanwege de lage transfectie effiëntie van casetes, bij het meten van exocytose van endógenos mediators slechts een kleine fractie van cellen wordt expressie van de & # 39manipuleren & # 39 test-DNA. Dus, bij het meten exocitose van mediadores endógenos, de bijdrage van de getransfecteerde cellen om het totale uitlezing gering. Daarom proberen om een ​​dergelijke benadering van de complexe netwerken in verband met gereguleerde exocitose bij MCs verkennen se vio obstaculizado. Deze techniek overint het obstakel van de lage transfectie-effiëntie en biedt een eenvoudige manier om fenotypische afwisselingen van MC SG & # 39s veroorzaakt door over-expressie, knock-down en muttagenese van genen van belang te observeren.

    Deze techniek kan worden uitgebreid onderzoeken van de hiërarchie en de interactie van functionele netwerken con transiënte drievoudige transfectie. De resultaten worden geanalyseerd om te bepalen welk gen een bepaald fenotype kan redden leiden tot een meer dramatische fenotype of hebben geen effect. Op base van dergelijke combinatorische transfecties kan exocitose net worden geconstrueerd. Bijvoorbeeld conoció a drievoudige transfectie konden we de SNARE eiwitten VAMP8 identificeren as een stroomafwaartse mediator in het process van Rab5 afhankelijke SG fusion 25.

    Deze methode maakt visualisatie en kwantificatie van exoctose in de resolutie van enkele SGS. Inderdaad waren, in staat om aan te tonen dat de SG, mostramos diferentes reacciones frente a los estímulos. De reden waarom bepaalde SG gefuseerd met de plasmamembraan terwijl anderen niet of de reden voor het verschil kinetiek van MC SG fusie nog worden vastgesteld. Los estudios de Toekomstige se reunieron con behulp van deze experimentantele aanpak hebben het potentieel om deze vragen te beantwoorden. Zo moet kwantificering van verschillende SNARE de Rabs op individuele SGS en correlatie met exocytose competeie en de kinetiek van exocytose in de resolutie van een enkele SG nieuwe regulatoren van exocytose onthullen.

    De belangrijkste beperking van deze techniek es de genetische manipulatie vanwege overexpressie van een eiwit celfunctie de morfologie kunnen beïnvloeden. Daarom es het essentieel om de resultaten met complementaire aanpak valideren. Wanneer bijvoorbeeld overexpressie van een constitutief actieve mutante exocitose remt het effect van een constitutieve negatieve mutant of neerslaan van het gen moet ook worden getest.

    Met deze techniek, identificamos neuwe regulatoren van MC functies, die MC exocitose beïnvloeden of de SG morfologie veranderen. De combinatie van exocytose metingen con SG morfometrische karakterisering geeft dieper inzicht in de functie en werkingsmechanismen van de geteste eiwitten.

    Se requiere suscripción. Recomiende JoVE a su bibliotecario.

    Expresiones de gratitud

    Wij danken Dr. U. Ashery para dar van NPY-mRFP cDNA. Wij danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, en Y. Zilberstein voor onschatbare hulp bij microscopie en het beeld analyseert. Estamos empapados de Dr. Joseph Orly voor kritische lezing van dit manuscrito. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Israel Science Foundation, opgericht door de Israëlische Academie voor Wetenschappen (1139-1112 naar RS-E.).


    Discusión

    En este estudio, utilizamos varias técnicas de microscopía para visualizar el proceso secretor en las glándulas de cemento de B. improviso cyprids. Este análisis nos permitió caracterizar la morfología y la dinámica de las vesículas secretoras durante la secreción estimulada. Además, los datos son consistentes con un proceso secretor exocitótico para la liberación de cemento por parte de los cipridos. Tras la estimulación de la secreción de cemento en cipridos intactos, las vesículas secretoras experimentan una serie de cambios, comenzando con una inflamación inicial hasta el vaciado completo del contenido. La microscopía DIC permitió la visualización directa de la secreción exocitótica en vivo.

    Microscopía confocal de una glándula de cemento ciprido vivo teñida de naranja acridina. La larva se inmovilizó en un cubreobjetos utilizando Kwik Sil y se obtuvieron imágenes. (A) Glándula de cemento no estimulada dentro del ciprés vivo. (B) El ciprido se estimuló con dopamina (1 mmol l -1) y se obtuvieron imágenes 15 minutos más tarde. Obsérvense las vesículas secretoras teñidas de forma brillante en la glándula de control (A) y su pérdida y la aparición de grandes vacuolas después de la estimulación.

    Microscopía confocal de una glándula de cemento ciprido vivo teñida de naranja acridina. La larva se inmovilizó en un cubreobjetos utilizando Kwik Sil y se obtuvieron imágenes. (A) Glándula de cemento no estimulada dentro del ciprés vivo. (B) El ciprido se estimuló con dopamina (1 mmol l -1) y se obtuvieron imágenes 15 min más tarde. Obsérvese las vesículas secretoras teñidas de forma brillante en la glándula de control (A) y su pérdida y la aparición de grandes vacuolas después de la estimulación.

    La observación de que los gránulos secretores experimentan una serie de cambios morfológicos tras la estimulación de la secreción es significativa y puede ser algo similar a dos informes anteriores sobre la secreción de cemento de percebe (Okano et al., 1996 Walker, 1971). Walker describió la morfología de la glándula de cemento tanto en natación libre como en asentada Anfitrito de Balanus cyprids. Descubrió que la glándula de cemento en animales no asentados contiene una gran cantidad de gránulos densos con un diámetro de aproximadamente 3-5 μm, dentro de células columnares, y las llamó células α. También describió otro tipo de células, las células β, con gránulos que tenían una apariencia reticulada. Además, Walker observó vacuolas en la parte apical de las células α, donde se había descargado material dentro de las glándulas de los cipridos asentados. Encontramos que en los cipridos no estimulados, las glándulas de cemento contienen pequeños gránulos secretores de núcleo denso, que comienzan a hincharse minutos después de la estimulación con dopamina. Los gránulos hinchados pierden gradualmente su contenido, posiblemente debido a la secreción, para finalmente convertirse en orgánulos vacíos en forma de vacuola. De hecho, la aparición de vacuolas se produjo cerca del surco central mediano de las glándulas de cemento, similar al hallazgo de Walker. Además, al igual que Walker, ocasionalmente encontramos gránulos con apariencia de tipo 2 o tipo 3 en glándulas de cemento cipridas no estimuladas de control. En las glándulas de cemento de los cipridos estimulados con dopamina, siempre encontramos los tres tipos diferentes de gránulos y vacuolas dentro de las mismas células (Figs. 2, 4B, 9B, C).

    Este hallazgo podría cuestionar la afirmación anterior de que existen diferentes tipos de células en las glándulas de cemento cipridas que contienen diferentes tipos de gránulos que posiblemente difieran en sus composiciones de proteínas (Walker, 1971). El hecho de que Walker haya encontrado vacuolas y gránulos reticulados en cipridos no asentados podría indicar que las larvas de cipridos, así como los cipridos recientemente asentados, podrían haber experimentado una secreción parcial de cemento, asociada con el asentamiento larvario. La formación de vacuolas sugiere que se ha producido una secreción, posiblemente en un intento de asentamiento por parte del ciprés (ver más adelante). Se han observado estructuras similares a vacuolas en otros sistemas secretores donde las células secretoras contienen vesículas secretoras de núcleo denso, p. células acinares pancreáticas (Cho et al., 2002b Raraty et al., 2000), epitelio gastrointestinal (Crivellato et al., 2002b Kuver et al., 2000) y mastocitos (Crivellato et al., 2002a). Hace más de dos décadas se realizaron observaciones similares de exocitosis y recuperación de membranas en la neurosecreción de invertebrados en la glándula del seno del cangrejo (May y Golding, 1983 Morris y Nordmann, 1980).

    El dogma actual en el caso de la sedimentación de cipridos es que la secreción de cemento ocurre en forma de todo o nada. La observación de gránulos con pérdida parcial de contenido en glándulas de cemento cíprido no estimuladas normales podría sugerir que puede ocurrir algo de secreción en ausencia de sedimentación en una forma de desgranulación fragmentada (Aravanis et al., 2003 Crivellato et al., 2003). En segundo lugar, es posible que solo algunas de las células secretoras de cemento participen en la secreción durante un intento de asentamiento, evitando otras células para proporcionar al ciprido la posibilidad de múltiples intentos de asentamiento. Finalmente, la conclusión de que los diferentes tipos de gránulos que se encuentran en las glándulas de cemento estimuladas efectivamente representan gránulos que han sufrido diversos grados de pérdida de contenido, cuestiona la idea de que puedan existir vesículas con diferente composición intragranular para apoyar el curado del cemento. Si bien es muy posible que varias proteínas diferentes formen el cemento secretado, no está claro si se derivan de múltiples tipos de gránulos secretores. No se sabe lo suficiente de la composición del contenido de las vesículas, ni del cemento, para concluir si el adhesivo de percebe es un pegamento monocomponente o multicomponente. Se sabe que las vesículas secretoras de núcleo denso en general contienen múltiples proteínas y otros componentes que forman una mezcla compleja que se mantiene en concentraciones extremadamente altas dentro de las vesículas (Lagercrantz, 1976 Uvnäs et al., 1970 Winkler, 1976). Es muy probable que todos los componentes necesarios que componen el adhesivo de percebe se almacenen dentro de las vesículas de manera que, tras la secreción, la interacción con el agua de mar o superficies sólidas con las características químicas adecuadas dé como resultado el endurecimiento del pegamento. Se necesita información más detallada de la química del cemento o del contenido de los gránulos para comprender con precisión el mecanismo de curado del adhesivo.

    Visualización de la secreción de cemento ciprido bajo óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC). Se inmovilizó una larva de ciprés en agarosa y se observó en una cámara de cubreobjetos usando un microscopio invertido usando óptica DIC. El montaje muestra una serie de imágenes separadas por intervalos de 10 s. Las imágenes se organizan comenzando en la parte superior y yendo de izquierda a derecha. Note la apariencia de una vacuola que parece agrandarse con el tiempo (flecha). Tenga en cuenta el aumento en el tamaño del saco de cemento entre los fotogramas 1 y 12. Consulte el material complementario para una secuencia de película de los datos originales en http://vivaldi.zool.gu.se/film/Movie-2-sm.movand http: //vivaldi.zool.gu.se/film/Movie-2-sm.avi.

    Visualización de la secreción de cemento ciprido bajo óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC). Se inmovilizó una larva de ciprés en agarosa y se observó en una cámara de cubreobjetos utilizando un microscopio invertido utilizando óptica DIC. El montaje muestra una serie de imágenes separadas por intervalos de 10 s. Las imágenes se organizan comenzando en la parte superior y yendo de izquierda a derecha. Note la apariencia de una vacuola que parece agrandarse con el tiempo (flecha). Tenga en cuenta el aumento en el tamaño del saco de cemento entre los fotogramas 1 y 12. Consulte el material complementario para una secuencia de película de los datos originales en http://vivaldi.zool.gu.se/film/Movie-2-sm.movand http: //vivaldi.zool.gu.se/film/Movie-2-sm.avi.

    Confirmamos las observaciones publicadas anteriormente de que la dopamina y, en menor medida, la noradrenalina estimulan la secreción de cemento de las larvas de ciprés (Okano et al., 1996). La principal diferencia entre el trabajo publicado anteriormente y el presente estudio es que los experimentos de Okano se llevaron a cabo utilizando preparaciones de glándulas de cemento aisladas. in vitro mientras que nuestro estudio se realiza en cipridos intactos en vivo. Quizás, por esa razón, nuestros experimentos requirieron una mayor concentración de dopamina para lograr la estimulación. La mayor concentración de dopamina podría inducir una secreción masiva de cemento y, en consecuencia, más hinchazón de los gránulos y formación de vacuolas (Kelly et al., 2004). Otra diferencia podría ser que el medio extracelular utilizado en los estudios de Okano no soportó la hinchazón de los gránulos como el líquido extracelular en el ciprido vivo que se mantiene en el agua de mar. Se sabe que el hinchamiento de los gránulos depende del pH medio, Ca 2+ (Espinosa et al., 2002) y la fuerza iónica (Finkelstein et al., 1986 Nanavati y Fernandez, 1993), que pueden diferir en las dos condiciones experimentales. En los gránulos de zimógeno del páncreas, se encontró que el mecanismo de hinchamiento de los gránulos durante la exocitosis estaba regulado por un proceso mediado por GTP que involucra a Gαi3 y acuaporina (Cho et al., 2002a).

    La estimulación con dopamina provoca la pérdida de vesículas secretoras y la aparición de vacuolas. Los cipridos se fijaron en diferentes momentos durante la exposición a la dopamina (1 mmol l –1) y se seccionaron. Las secciones se tiñeron con azul de toluidina y los diferentes tipos de vesículas en las secciones teñidas se contaron al microscopio. Tenga en cuenta que los gránulos de núcleo denso (tipo 1) se reducen en número con el tiempo, con un aumento proporcional en el número de vacuolas (tipo 4) después de 10 min de tratamiento con dopamina.

    La estimulación con dopamina provoca la pérdida de vesículas secretoras y la aparición de vacuolas. Los cipridos se fijaron en diferentes momentos durante la exposición a la dopamina (1 mmol l –1) y se seccionaron. Las secciones se tiñeron con azul de toluidina y los diferentes tipos de vesículas en las secciones teñidas se contaron al microscopio. Tenga en cuenta que los gránulos de núcleo denso (tipo 1) se reducen en número con el tiempo, con un aumento proporcional en el número de vacuolas (tipo 4) después de 10 min de tratamiento con dopamina.

    Microscopía óptica de glándulas de cemento estimuladas por dopamina. Las glándulas de cemento se fijaron en varios momentos durante la exposición a la dopamina y se cortaron las secciones. Las secciones teñidas con azul de toluidina se examinaron al microscopio. Nótese la ausencia de vacuolas en la glándula de control (A) y la aparición de vacuolas después de 4 min de exposición a dopamina (B), que aumentan en número después de 10 min de exposición (C).

    Microscopía óptica de glándulas de cemento estimuladas por dopamina. Las glándulas de cemento se fijaron en varios momentos durante la exposición a la dopamina y se cortaron las secciones. Las secciones teñidas con azul de toluidina se examinaron al microscopio. Nótese la ausencia de vacuolas en la glándula de control (A) y la aparición de vacuolas después de 4 min de exposición a dopamina (B), que aumentan en número después de 10 min de exposición (C).

    Como en la mayoría de los sistemas secretores, las proteínas del cemento se almacenan dentro de las vesículas a concentraciones extremadamente altas en un complejo coloidal con numerosos componentes, de modo que la presión osmótica dentro de las vesículas es baja (Kreuger et al., 1989). Se espera que las fuerzas de hidratación sobre el gránulo estén controladas por la presión osmótica coloide dentro de las vesículas y se modulan por cambios en la osmolalidad del medio circundante (Whitaker y Zimmerberg, 1987). El complejo intragranular necesita disociarse durante la exocitosis para que se produzca la secreción. En algunos gránulos, se ha observado un límite de fase entre el material compacto denso en electrones y el material amorfo menos compacto dentro de las vesículas, junto con la pérdida de material (véase Walker, 1971 para una comparación). Por lo tanto, la hinchazón de los gránulos después de la hidratación del contenido de los gránulos podría ser esencial para que se produzca la secreción. La estructura dentro de los gránulos de tipo 3, que aparecen como canales de hidratación, podría deberse a dichos cambios, y se han observado estructuras similares en otros gránulos de núcleo denso, como los gránulos corticales de huevo de erizo de mar y los gránulos de mastocitos (Dvorak y Morgan, 2000). Whalley y col., 2000).

    La exocitosis es un evento omnipresente en biología y se han sugerido varias hipótesis como posibles mecanismos moleculares. Parece probable que los mecanismos moleculares detallados de la exocitosis puedan diferir en diferentes sistemas secretores dependiendo de la velocidad fisiológicamente requerida del evento secretor exocitótico. Parece posible que en algunos sistemas celulares un solo gránulo pueda sufrir múltiples ciclos de fusión-secreción (para revisiones, ver Burgoyne y Morgan, 2003 Lindau y Alvarez de Toledo, 2003), lo que lleva a una secreción parcial del contenido de vesículas o una forma pulsátil de secreción. . Se ha observado una exocitosis parcial similar de tipo "besar y correr" en la liberación de transmisores sinápticos (Aravanis et al., 2003). Durante la exocitosis, la membrana granular pasa a formar parte transitoriamente de la membrana celular y luego se recupera selectivamente, y es posible que se produzcan ciclos rápidos entre un estado de fusión y un estado sin fusión (Burgoyne y Morgan, 2003 Schneider, 2001). La duración y el diámetro de la apertura del poro de fusión regularán la cantidad de material granular que se secreta para cada ciclo de secreción (Tsuboi y Rutter, 2003 Tabares et al., 2003). Por lo tanto, es posible que las vacuolas vacías, como los gránulos de tipo 4 que observamos, puedan resultar de múltiples rondas de exocitosis parcial o exocitosis completa y vaciamiento total.

    En conclusión, los datos que presentamos aquí apoyan la sugerencia de que las vesículas secretoras de núcleo denso dentro de las glándulas de cemento en las larvas de ciprés se secretan a través de un proceso de exocitosis. La secreción exocitótica de cemento de cíprido de percebe se asemeja al evento secretor observado en muchos sistemas celulares de mamíferos, incluida la secreción pulsátil o parcial del contenido de los gránulos. Además, observamos cuatro tipos diferentes de gránulos de cemento en cipridos estimulados con dopamina. Con la excepción de los gránulos de tipo 1, todos los demás aparecen hinchados con pérdida parcial o total del contenido de los gránulos y pueden representar vesículas que han sufrido una pérdida parcial o total de su contenido. Por lo tanto, la glándula de cemento en los percebes parece ser un órgano exocrino regulado con precisión que es más complejo en su organización y regulación de lo que se pensaba anteriormente.


    Ver el vídeo: TEJIDO CONJUNTIVO: Fibroblastos, Macrófagos, Mastocitos (Julio 2022).


Comentarios:

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