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Gen de interés número de copias en K. pastoris transformado

Gen de interés número de copias en K. pastoris transformado



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Al transformar un K. pastoris cepa, ¿hay alguna manera de predecir cuántas copias del gen se integrarán después de la recombinación homóloga? Más específicamente, ¿es algo que un biólogo molecular es capaz de controlar de forma sencilla o, por lo general, se deja al azar (y se determina posteriormente mediante secuenciación genética)?

Alternativamente: si quiero transformar una cepa de tipo salvaje electrocompetente como Pichia X33 usando un vector plásmido, ¿la integración múltiple es un proceso iterativo que controlo o es aleatorio?)

Editar: Gracias a todos por las respuestas. Finalmente, si entiendo bien, el proceso es bastante aleatorio, pero puedes controlarlo hasta cierto punto. @gaspanic: mantengo la idea de usar reporteros fluorescentes y FACS para eso;)


Probablemente no sea posible predecir las integraciones numéricas, pero puede favorecer las integraciones múltiples, si eso es lo que busca. Al menos en Saccharomyces cerevisiae la integración de un primer plásmido parece estimular la inserción de plásmidos adicionales en el mismo sitio (1). Por lo tanto, es posible favorecer las integraciones múltiples (2) aumentando la relación ADN / célula en la transformación, aumentando así la posibilidad de que cualquier célula competente reciba más de una copia del plásmido, que luego podría integrarse en tándem. La forma más fácil es simplemente usar más ADN, pero dependiendo de su competencia celular, es posible que deba compensar este aumento usando menos células para su transformación (o simplemente colocando menos células en cada placa) ya que probablemente también aumentará el rendimiento general de la colonia. .

Una forma de seleccionar activamente para múltiples integraciones es usar un inhibidor competitivo para el marcador de selección. De nuevo, en Saccharomyces cerevisiae transformaciones con HIS3 La selección se puede combinar con 3-AT (3). Esto le permite inhibir HIS3 actividad lo suficiente para permitir sólo el crecimiento de células que han integrado un número deseado de copias del plásmido. Por supuesto, este método está lejos de ser infalible, ya que también puede seleccionar mutantes que han aumentado HIS3 expresión por otras razones. Editar: De hecho, encontré un artículo haciendo esto en K. pastoris (4).

Finalmente, si su implementación lo permite, puede facilitar la selección de integraciones múltiples al incluir un casete fluorescente que exprese proteínas en su plásmido. De esa manera, puede detectar fácilmente diferentes números de integraciones mediante microscopía de fluorescencia o FACS.

Fuentes:

  1. Orr-Weaver y col. (1983): https://mcb.asm.org/content/3/4/747
  2. Plessis y Dujon (1993): https://doi.org/10.1016/0378-1119(93)90172-Y
  3. Wikipedia (consultado el 15 de agosto de 2020): https://en.wikipedia.org/wiki/3-Amino-1,2,4-triazole
  4. Menéndez et al. (2018): https://doi.org/10.2144/00295rr05

Pichia pastoris como huésped de expresión para la biología estructural de proteínas de membrana

Pichia pastoris es un sistema de expresión recombinante bien establecido.

En este sistema se han producido varias proteínas de membrana integrales.

La proteína se ha utilizado para resolver varias estructuras de alta resolución.

Características clave del P. pastoris se describen el sistema de expresión.

Se incluye un resumen de las herramientas disponibles para la expresión de proteínas de membrana.

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es un hospedador de expresión recombinante ampliamente utilizado. P. pastoris combina las ventajas de la facilidad de uso, los tiempos de expresión relativamente rápidos y el bajo costo con los sistemas de procesamiento y la composición lipídica eucariotas cotraduccionales y postraduccionales. La idoneidad de P. pastoris para cultivos controlados de alta densidad en biorreactores significa que se pueden obtener grandes cantidades de proteína a partir de pequeños volúmenes de cultivo. Esta revisión detalla las características clave de P. pastoris, que lo han convertido en un sistema particularmente útil para la producción de proteínas de membrana, incluidos receptores, canales y transportadores, para estudios estructurales. Además, esta revisión proporciona una descripción general de todas las construcciones y cepas celulares utilizadas para producir proteínas de membrana, que han producido estructuras de alta resolución.


Guía para la purificación de proteínas, segunda edición

James M. Cregg,. Thomas Chappell, en Métodos en enzimología, 2009

Abstracto

La levadura Pichia pastoris se ha convertido en el principal ejemplo de especies de levadura utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. Las ventajas de esta levadura para la expresión incluyen promotores eficientes y estrechamente regulados y una fuerte tendencia al crecimiento respiratorio en oposición al crecimiento fermentativo. Este capítulo asume que el lector es competente en biología molecular y detalla los procedimientos más específicos de levadura involucrados en la utilización de la P. pastoris sistema de expresión génica. Los procedimientos que se encuentran aquí incluyen: construcción de cepas por genética de levadura clásica, la lógica en la selección de un vector y una cepa, preparación de células de levadura electrocompetentes y transformación por electroporación, y el método de transferencia de Western de colonias de levadura o transferencia de Yeastern para visualizar las proteínas secretadas alrededor de la levadura. colonias.


Guía para la purificación de proteínas, segunda edición

James M. Cregg,. Thomas Chappell, en Métodos en enzimología, 2009

Abstracto

La levadura Pichia pastoris se ha convertido en el principal ejemplo de especies de levadura utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. Las ventajas de esta levadura para la expresión incluyen promotores eficientes y estrechamente regulados y una fuerte tendencia al crecimiento respiratorio en oposición al crecimiento fermentativo. Este capítulo asume que el lector es competente en biología molecular y detalla los procedimientos más específicos de levadura involucrados en la utilización de la P. pastoris sistema de expresión génica. Los procedimientos que se encuentran aquí incluyen: construcción de cepas por genética de levadura clásica, la lógica en la selección de un vector y una cepa, preparación de células de levadura electrocompetentes y transformación por electroporación, y el método de transferencia de Western o Yeastern de colonias de levadura para visualizar proteínas secretadas alrededor de la levadura. colonias.


Romanos, M.A., anotador, C.A. y Clare, J.J. 1992. Expresión de genes extraños en levaduras: una revisión. Levadura 8: 423–488.

Cregg, JM, Tschopp, JF, Stillman, C., Siegel, R., Akong, M., Craig, WS, Buckholz, RG, Madden, KR, Kellaris, PA, Davies, GR, Smiley, BL, Cruze, J ., Torregrossa, R., Velicelebi, G. y Thill, GP 1987. Expresión de alto nivel y ensamblaje eficiente del antígeno de superficie de la hepatitis B en la levadura metilotrófica. Pichia pastoris. Biotecnología 5: 479–485.

Sreekrishna, K., Nelles, L., Potenz, R., Cruze, J., Mazzaferro, P., Fish, W., Motohiro, F., Holden, K., Phelps, D., Wood, P. y Parker, K.1989 Expresión, purificación y caracterización de alto nivel del factor de necrosis tumoral humano recombinante sintetizado en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Bioquímica 28: 4117–4125.


Introducción

La levadura no convencional Pichia pastoris es un huésped popular para la producción de proteínas recombinantes, debido a un mecanismo de secreción altamente eficiente y la posibilidad de alcanzar altos títulos de producto para enzimas más simples como la fitasa y proteínas complejas que contienen múltiples modificaciones postraduccionales, p. anticuerpos monoclonales 1,2,3,4,5. Investigación de Kurtzman et al. 6,7 resultó en la reclasificación de la P. pastoris género como Komagatella, incluida la subespecie K. phaffii y K. pastoris. Sin embargo, todavía se les conoce comúnmente como P. pastoris. En los últimos años, la caja de herramientas genéticas para P. pastoris se ha expandido notablemente con varios promotores nativos recientemente descubiertos, promotores sintéticos y otros elementos reguladores 8,9,10,11. La construcción de cepas y vectores optimizados permitió nuevas aplicaciones, p. Ej. la producción de metabolitos o expresión de proteínas que carecen de patrones de hipermanosilación específicos de levadura 12,13. Además, en una publicación muy reciente, Weninger et al. 14 reportaron el primer sistema CRISPR / Cas9 para P. pastoris abriendo nuevas posibilidades para los enfoques de la ingeniería genética.

No obstante, el enfoque más utilizado para introducir el gen diana en P. pastoris sigue siendo la integración de un casete de expresión en el genoma vía recombinación homóloga. El objetivo más popular para la integración es el AOX1 (alcohol oxidasa 1) locus que representa la expresión más fuerte de las dos alcohol oxidasas en P. pastoris. Este enfoque generalmente implica la utilización de AOX1 promotor (pAOX1) como secuencia homóloga y como promotor del gen diana, porque ofrece niveles de expresión muy altos y una regulación estricta 15. Después de una integración exitosa, la expresión génica se puede inducir con metanol. Sin embargo, un clon con un intacto AOX1 puede metabolizar el metanol a una tasa mayor, denominada “utilización de metanol plus” (Mut +), lo que complica el mantenimiento de una inducción constante 16,17. Por tanto, la aplicación de casetes de expresión con dos secuencias homólogas dirigidas a mediar la sustitución de AOX1 es una técnica posible. Una mutación knock-out de AOX1 conduce al fenotipo “utilización lenta de metanol” (Mut S), lo que facilita el control del proceso y permite seleccionar para una integración correcta en función del fenotipo.

A pesar de utilizar secuencias homólogas comparativamente largas (ca. 1000 pb), se observa una alta variación en la eficiencia de la focalización, lo que indica la prevalencia de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) en P. pastoris 18,19,20. Como resultado, se encuentra una alta variabilidad clonal después de la transformación, lo que requiere un proceso de selección intensivo en tiempo y mano de obra para el clon con las características deseadas 21,22. Con respecto a las características de productividad, los diferentes niveles de expresión de los clones se originan típicamente a partir de diferentes números de copias de genes 23,24. La variabilidad clonal se considera una propiedad inherente de P. pastoris que es un subproducto de las técnicas de transformación disponibles y establecidas en combinación con la fuerte vía NHEJ en esta especie de levadura. Muchas otras levaduras, hongos filamentosos y eucariotas superiores que se utilizan en aplicaciones biotecnológicas muestran variabilidades clonales similares o más pronunciadas debido a una vía NHEJ predominante 25,26,27, mientras que en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae la recombinación homóloga es dominante sobre la vía NHEJ 28. Diferentes técnicas para reducir la variabilidad clonal en P. pastoris Se han propuesto 14,18,20,29. Sin embargo, desventajas como alta complejidad, menor aptitud de la cepa o métodos aún no completamente realizados para la integración del casete de donantes han impedido que estas técnicas reemplacen a las establecidas para la construcción eficiente de cepas productoras. Por lo tanto, los pasos sucesivos de manipulación genética, p. Ej. para la construcción de vías biosintéticas, han sido comparativamente desafiantes en P. pastoris y hasta ahora solo se han reportado unas pocas aplicaciones 30,31,32,33,34. Hasta la fecha, la humanización de la vía de N-glicosilación en P. pastoris a través de múltiples pasos de clonación consecutivos ha sido el esfuerzo de ingeniería genética más sofisticado y exitoso 13,35. Se han hecho observaciones similares para otras levaduras no convencionales como Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis y Yarrowia lipolytica 25,36,37 .

En nuestro estudio anterior 24, nos concentramos en analizar la variabilidad clonal encontrada en 845 P. pastoris cepas transformadas con un casete de expresión de GFP dirigido a AOX1 reemplazo. Al seleccionar todos los clones para su fenotipo Mut, se seleccionaron clones de productividad de GFP y número de copia del gen 31 con características interesantes para la secuenciación del genoma. La combinación de datos experimentales y del genoma permitió el descubrimiento de nuevos conocimientos sobre la correlación entre la productividad y el evento de integración. En la mayoría de los casos, las variaciones en la productividad podrían atribuirse a efectos relacionados con el número de copias de genes. No se encontraron integraciones fuera del objetivo en clones con una alta productividad, lo que sugiere que el impacto de tales eventos en la productividad fue bajo.

Durante el ensayo de fenotipo Mut, se descubrieron cepas que mostraban una morfología de colonia anormal en la placa. Algunos de estos clones también se seleccionaron para secuenciar el genoma. Aquí, discutimos los resultados para estas cepas, aclarando una variedad de eventos de integración fuera del objetivo aún no reportados. Además de la alteración de genes aleatorios, la cointegración de elementos de ADN del plásmido huésped E. coli KRX, así como la reubicación del AOX1 se descubrieron locus a otro cromosoma. El efecto perjudicial de estos eventos sobre la integridad genética y la morfología de la cepa presenta una carga adicional para el proceso de selección. Estas observaciones son especialmente relevantes para la ingeniería metabólica o los experimentos de knock-out en P. pastoris, mientras que los eventos de integración detallados en nuestro estudio anterior 24 son más pertinentes para los experimentos dirigidos a la creación de cepas de alta producción.

En los últimos años, la ingeniería metabólica de levaduras no convencionales en general y P. pastoris en particular ha ganado más interés 11,38. Por lo tanto, los eventos de integración discutidos y las teorías propuestas que explican su origen permitirán a los científicos que trabajan en este campo modificar los protocolos de transformación y mutagénesis existentes para evitar estos eventos. Con base en esta estrategia, se puede reducir la diversidad clonal y se pueden realizar procesos de ingeniería genética de mayor complejidad.


5. OTRAS BIOMOLÉCULAS PRODUCIDAS POR P. pastoris

los P. pastoris también se ha establecido como una fábrica de células versátil para la producción de miles de biomoléculas tanto a escala de laboratorio como industrial. Algunas de las nuevas moléculas biológicas recombinantes que se han expresado en el P. pastoris se enumeran en la Tabla & # x000a0 6.

Tabla 6

Pichia pastoris como hospedador adecuado para la producción de moléculas biológicas recombinantes

ProductoCepa usadaVector usadoUsoReferencia
Licopeno y & # x003b2 & # x02010carotenoX & # x0201033pGAPZASuplementos alimenticiosAraya & # x02010Garay, Feijoo & # x02010Siota, Rosa & # x02010dos & # x02010Santos, Veiga & # x02010Crespo y Villa (2012)
PlectasinaX & # x0201033pPICZ & # x003b1APéptido antibacterianoJ. & # X000a0Zhang y col. (2011)
Lactoferrina bovinaKM71HpJ902Transferrina y proteína antibacterianaIglesias & # x02010 Figueroa et al. (2016)
IFN bovino & # x02010 & # x003b1GS115pPIC9KPrevención y terapia de enfermedades virales.Tu y col. (2016)
ApidaecinaSMD1168pPIC9KPéptido antibacterianoX. Chen y col. (2017)
hPAB & # x02010 & # x003b2GS115pPIC9KPéptido antibacterianoZ. Chen y col. (2011)
Taquiplesina IGS115pGAPZ & # x003b1BPéptido antibacterianoH. Li y col. (2019)
Serpiente & # x020101GS11pPIC9Péptido antimicrobianoKuddus y col. (2016)
PAF102X & # x0201033pGAPZAPéptido antifúngicoPopa, Shi, Ruiz, Ferrer y Coca (2019)
Pisum sativum defensina 1GS115pPIC9KPéptido antifúngicoCabral, Almeida, Valente, Almeida y Kurtenbach (2003)
Quitinasa de clase IKM71HpPICZ & # x003b1APéptido antifúngicoLandim y col. (2017)
Ch & # x02010penaeidinaKM71HpPIC9KPéptido antimicrobianoL. Li y col. (2005)
HispidalinGS115pPICZ & # x003b1APéptido antimicrobianoMeng y col. (2019)
Fowlicidin & # x020102X & # x0201033pPICZ & # x003b1APéptido antimicrobianoXing y col. (2016)
Parásito yoX & # x0201033pPICZ & # x003b1APéptido antimicrobianoH. Zhao y col. (2015)
CecropinA & # x02010thanatinX & # x0201033pPICZ & # x003b1APéptido antimicrobianoZ. Liu y col. (2018)
Colágeno tipo I Tejido conectivoNokelainen y col. (2001)
Albúmina de suero humanoGS115pPIC9KMantener la osmolaridad y el portador en sangre.W. Zhu y col. (2018)
LegumainX & # x0201033pPICZ & # x003b1AProteasa lisosomalT. Zhao y col. (2018)
Quimosina de cabraX & # x0201033pPICZ & # x003b1AHidrólisis de & # x003ba & # x02010caseínaTyagi y col. (2016)
Proteína anticongelante de zanahoriaGS115pPIC9KInhibición del deterioro del gluten.M. Liu y col. (2018)
ProinsulinaSuperMan5pPICZ & # x003b1ATratamiento de la diabetes mellitusBaeshen y col. (2016)
hIFN & # x02010 & # x003b3X & # x0201033, GS115, KM71H, CBS7435pPICZ & # x003b1, pPIC9, pPpT4aSCitoquinas críticas para la inmunidad innata y adaptativaRazaghi y col. (2017)
IL & # x020101 & # x003b2GS115, SMD1168, X & # x0201033pPICZ & # x02010ACitoquina proinflamatoriaLi y col. (2016)
IL & # x020103X & # x0201033pPICZ & # x003b1ACitocina hematopoyética multipotenteDagar y Khasa (2018)
IL & # x0201011GS115pPINK & # x003b1HCFactor de crecimiento trombopoyéticoYu y col. (2018)
IL & # x0201015X & # x0201033pPICZ & # x003b1ADiferenciación y proliferación de células T, B y NKW. Sun y col. (2016)
Cianato hidratasaGS115pPICZ & # x003b1ADesintoxicación de cianato y cianuroRanjan, Pillai, Permaul y Singh (2017)
Anticuerpo scFv antiplaquetario humanoX & # x0201033pPICZ & # x003b1ATratamiento de la aterosclerosis.Vallet & # x02010Courbin et al. (2017)
& # x003b1 & # x02010 AmilasaX & # x0201033pPICZ & # x003b1ASacarificación del almidónParashar y Satyanarayana (2017)
Factor de crecimiento epidérmico humanoGS115pPIC9KGeneración de nuevas células epiteliales y endoteliales.Eissazadeh y col. (2017)
BromelinaKM71HpPICZ & # x003b1AInflamaciones edematosasLuniak, Meiser, Burkart y M & # x000fcller (2017)
Factor de crecimiento de queratinocitosX & # x0201033pPICZ & # x003b1AEpitelización y # x02010fase de cicatrización de heridasKalhor (2016)
DM64X & # x0201033pPICZ & # x003b1AAnti & # x02010miotóxicoVieira, da Rocha, da Costa Neves & # x02010 Ferreira, Almeida y Perales (2017)
TripsinaGS115pPIC9KHidrólisis de proteínas en el sistema digestivo.Y. Zhang y col. (2018)
Sialiltransferasa humanaKM71HpPICZ & # x003b1BUsos farmacológicosLuley & # x02010Goedl et al. (2016)
TransglutaminasaGS115pPIC9KProductos cárnicos reestructuradosX. Yang y Zhang (2019)
EstreptoquinasaX & # x0201033pPICZ & # x003b1AMedicación trombolítica.Dagar, Devi y Khasa (2016)
EstafilocinasaGS115, KM71HpPICZ & # x003b1AMedicación trombolítica.Faraji y col. (2017)
TFPR1X & # x0201033pPICZ & # x003b1AAuxiliarNing y col. (2016)

Abreviaturas: hIFN & # x02010 & # x003b3, interferón humano & # x003b3 IL, interleucina NK, asesino natural.


Pasos en la clonación de genes

Los 7 pasos básicos involucrados en la clonación de genes son:

  1. Aislamiento de fragmentos de ADN [gen de interés] a clonar.
  2. Inserción de ADN aislado en un vector adecuado para formar ADN recombinante.
  3. Introducción de ADN recombinante en un organismo adecuado conocido como huésped.
  4. Selección de células hospedadoras transformadas e identificación del clon que contiene el gen de interés.
  5. Multiplicación / Expresión del gen introducido en el anfitrión.
  6. Aislamiento de múltiples copias de genes / Proteína expresada por el gen.
  7. Purificación de la copia / proteína del gen aislado

A. Aislamiento del gen o fragmento de ADN

  • Primero se debe aislar el ADN o gen diana que se va a clonar. Un gen de interés es un fragmento de gen cuyo producto (una proteína, una enzima o una hormona) nos interesa. Por ejemplo, gen que codifica la hormona insulina.
  • El gen deseado puede aislarse usando la enzima endonucleasa de restricción (RE), que corta el ADN en secuencias de nucleótidos de reconocimiento específicas conocidas como sitios de restricción hacia la región interna (por lo tanto, endonucleasa) produciendo extremos romos o pegajosos.
  • A veces, también se puede usar la enzima transcriptasa inversa que sintetiza la cadena de ADN complementaria del gen deseado usando su ARNm.

B. Selección del vector de clonación adecuado

  • El vector es una molécula portadora que puede llevar el gen de interés (GI) a un huésped, replicarse allí junto con el GI haciendo sus múltiples copias.
  • Los vectores de clonación están limitados al tamaño del inserto que pueden transportar. Dependiendo del tamaño y la aplicación del inserto se selecciona el vector adecuado.
  • Los diferentes tipos de vectores disponibles para la clonación. son plásmidos, bacteriófagos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) y cromosomas artificiales de mamíferos (MAC).
  • Sin embargo, los vectores de clonación más comúnmente utilizados incluyen plásmidos y bacteriófagos (fago λ) además de todos los demás vectores disponibles.

C.Características esenciales de los vectores de clonación

Todos los vectores de clonación son moléculas de ADN portadoras. Estas moléculas portadoras deberían tener algunas características comunes en general, tales como:

  • Debe ser autorreplicante dentro de la célula huésped.
  • Debe poseer un sitio de restricción único para las enzimas RE.
  • La introducción del fragmento de ADN del donante no debe interferir con la propiedad de replicación del vector.
  • Debe poseer algún gen marcador de modo que pueda usarse para la identificación posterior de la célula recombinante (generalmente un gen de resistencia a antibióticos que está ausente en la célula huésped).
  • Deben aislarse fácilmente de la célula huésped.

D. Formación de ADN recombinante

  • El vector plasmídico se abre mediante la misma enzima RE utilizada para el aislamiento del fragmento de ADN del donante.
  • La mezcla del fragmento de ADN del donante y el vector plasmídico se mezclan.
  • En presencia de ADN ligasa, se produce el apareamiento de bases del fragmento de ADN del donante y el vector plasmídico.
  • La molécula de ADN resultante es un híbrido de dos moléculas de ADN: el GI y el vector. En la terminología de la genética, esta mezcla de diferentes cadenas de ADN se denomina recombinación.
  • Por lo tanto, esta nueva molécula de ADN híbrido también se denomina molécula de ADN recombinante y la tecnología se conoce como la tecnología de ADN recombinante.

E. Transformación del vector recombinante en un hospedador adecuado

  • El vector recombinante se transforma principalmente en una célula huésped adecuada, una célula bacteriana.
  • Esto se hace por una o ambas de las siguientes razones:
    • Replicar la molécula de ADN recombinante para obtener las múltiples copias del GI.
    • Permitir la expresión del IG de modo que produzca su producto proteico necesario.
    • Algunas bacterias son naturalmente transformables y absorben el vector recombinante automáticamente.

    Por ejemplo: Bacilo, Haemophillus, Helicobacter pylori, que son naturalmente competentes.


    Expresión de proteínas recombinantes en Pichia Pastoris

    Pichia pastoris se ha utilizado ampliamente y con éxito para expresar proteínas recombinantes. En esta revisión, resumimos los elementos necesarios para expresar proteínas heterólogas y discutimos varios factores en la aplicación de este sistema para la expresión de proteínas. Estos elementos incluyen vectores, cepas hospedadoras, integración de genes heterólogos en el genoma, factores de secreción y perfil de glicosilación. En particular, discutimos y evaluamos el progreso reciente en la optimización del proceso de fermentación para mejorar el rendimiento y la estabilidad de las proteínas expresadas. La optimización se puede lograr controlando la composición del medio, el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto, así como mediante la inducción de metanol y el modo de alimentación.

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    Resultados y discusión

    doradoPiCS, nuestro derivado de Golden Gate P. pastoris sistema de clonación, consta de tres niveles de estructura jerárquica (BB) para la generación flexible de plásmidos de sobreexpresión que contienen múltiples unidades de transcripción (hasta ocho por plásmido), cuatro marcadores de selección diferentes y cinco loci para la integración del genoma dirigido o el mantenimiento del plásmido episomal (Fig.1 ). Diseñamos principalmente el sistema para permitir la ingeniería celular avanzada o la expresión de vías metabólicas completas. En el nivel de clonación más bajo, las partes individuales como los promotores, las secuencias codificantes (por ejemplo, indicadores o GOI) y los terminadores de la transcripción se incorporan en los plásmidos del esqueleto 1 (BB1), que posteriormente se ensamblan en una unidad de transcripción en BB2. A esto le sigue el ensamblaje de múltiples unidades de expresión en un BB3, que está diseñado para la posterior integración del genoma en P. pastoris (Se encuentran disponibles cuatro marcadores de selección diferentes y cuatro loci para la integración del genoma dirigido). A diferencia de otras técnicas de clonación, Golden Gate Assembly evita la necesidad de una secuenciación excesiva, porque las construcciones BB2 y BB3 se ensamblan mediante ligación en lugar de PCR de superposición-extensión (solo las inserciones BB1 requieren secuenciación después del ensamblaje). La ligadura correcta está asegurada por sitios de fusión definidos (ver Fig. 1): Los sitios de fusión Fs1 a Fs4 se enlazan a partes individuales por PCR y se requieren para su ensamblaje en una unidad de transcripción (BB2) p. promotores con secuencias codificantes ("CATG", sitio de fusión Fs2). Los sitios de fusión FsA a FsI se utilizan para el ensamblaje de múltiples unidades de expresión en BB3, p. Ej. para fusionar la primera unidad de transcripción con la segunda ("CCGG", sitio de fusión FsB). Los diferentes vectores BB3 con sitios de fusión FsA-FsC, FsA-FsD, a FsA-FsI están diseñados para el ensamblaje de dos, tres,… hasta ocho unidades de transcripción en un solo plásmido. Interno Bsayo y BpiLos sitios de restricción deben eliminarse en todos los módulos mediante la introducción de mutaciones puntuales, teniendo en cuenta el uso de codones de P. pastoris.

    Estrategia de ensamblaje y niveles de backbone jerárquico de los sistemas de clonación GoldenMOCS y GoldenPiCS. En la plataforma general independiente de microorganismos GoldenMOCS, los productos de ADN (ADN sintético, productos de PCR u oligonucleótidos) se integran en BB1 mediante un BsaI Sitios de ensamblaje y fusión Golden Gate Fs1, Fs2, Fs3 y Fs4. Los sitios de fusión se indican como cuadros de colores con el número o la letra del sitio de fusión correspondiente. Los elementos genéticos básicos contenidos en la columna vertebral 1 (BB1) se pueden ensamblar en el receptor BB2 realizando una BpiI reacción de GGA. Las unidades de transcripción en BB2 se utilizan además para BsaMe ensamblo en construcciones BB3 multigénicas. Las unidades de transcripción única se pueden obtener directamente BpiMonto en el receptor BB3 con los sitios de fusión Fs1-Fs4. Los sitios de fusión determinan las posiciones de los módulos y las unidades de transcripción en construcciones ensambladas. Por tanto, los sitios de fusión Fs1 a Fs4 se utilizan para construir casetes de expresión únicos en BB2 y se requieren entre el promotor (Fs1-Fs2), CDS (Fs2-Fs3) y el terminador (Fs3-Fs4). Los sitios de fusión FsA a FsI están diseñados para construir plásmidos BB3 y separar los diferentes casetes de expresión entre sí. Las FS son secuencias elegidas casi al azar y solo FS2 tiene una función especial, porque incluye el codón de inicio ATG. doradoPiCS incluye además BB1 que contienen módulos específicos para P. pastoris: 20 promotores, 1 gen indicador (eGFP) y 10 terminadores de la transcripción, y vectores receptores BB3 que contienen diferentes loci de integración para la integración estable del genoma en P. pastoris y casetes de resistencia adecuados (archivo adicional 2)

    Anteriormente, los enfoques de ingeniería de deformaciones con P. pastoris a menudo dependía de pGAPz, pPIC6 (Invitrogen) o vectores de expresión relacionados, que albergan sólo una unidad de transcripción (Fig. 2). La clonación de concatémeros que contienen más de dos unidades de transcripción demostró consumir mucho tiempo y también condujo a eventos de integración impredecibles cuando se utilizan secuencias promotoras y terminadoras repetitivas [23, 24]. Por lo tanto, la sobreexpresión convencional de norte genes requiere norte ciclos de preparación de células competentes y su transformación, y el uso de norte diferentes marcadores de selección. Para la sobreexpresión de tres factores más cribados usando transformaciones consecutivas, el procedimiento tomaría al menos 31 días (cuatro días para transformación y re-rayado, cinco días para cribado y dos días para preparar células competentes Fig. 2, panel superior). Además, los marcadores de selección se pueden eliminar y reciclar, con el costo de un ciclo adicional de fabricación y transformación competentes (Fig. 2, panel central). Además de eso, debe incluirse el uso de diferentes loci de integración para evitar incidentes de "bucle de salida" del ADN integrado. Alternativamente, se puede considerar la cotransformación de múltiples vectores, pero esto requiere el uso de varios marcadores de selección independientes; de lo contrario, en nuestra experiencia, la eficiencia de transformación es baja y es muy impredecible si todos los vectores se integran en el genoma [25]. Nuestros plásmidos BB3 Golden Gate de la columna vertebral pueden transportar múltiples unidades de transcripción y, por lo tanto, simplificar y acortar significativamente el procedimiento a un solo paso de transformación. La integración de múltiples unidades de transcripción más el cribado dura solo nueve días (Fig. 2, panel inferior). Las cepas así generadas se benefician de la disminución del número de generaciones y de los procedimientos de selección más suaves.

    Comparación de estrategias de ingeniería de deformaciones convencionales y basadas en Golden Gate para P. pastoris. Sobreexpresión de múltiples genes (GOI) en P. pastoris el uso de plásmidos de clonación convencionales requiere varias rondas de elaboración competente (2 días), transformación (4 días, incluida la segunda racha) y cribado de clones (5 días) y toma al menos 31 días para tres genes con tres marcadores de selección. Alternativamente, se pueden cotransformar múltiples vectores a la vez, pero las eficiencias de transformación resultantes suelen ser muy bajas y aumenta la variación clonal. Los sitios flanqueantes apropiados para el marcador de selección (sitios loxP o FRT) permiten el reciclado del marcador por recombinasas (Cre o Flp, respectivamente), pero requieren una ronda más de elaboración y transformación competentes que requiere al menos ocho días adicionales. Los plásmidos Golden Gate llevan varias unidades de transcripción a la vez y, por lo tanto, permiten la transformación y el cribado en solo nueve días.

    Los eventos de recombinación por secuencias repetitivas perturban la integración completa del vector en P. pastoris

    Inicialmente, comenzamos con vectores Golden Gate que llevaban hasta cuatro unidades de transcripción con el mismo promotor y terminador de transcripción (PAG BRECHA y ScCYC1tt). La alta variación clonal nos llevó a analizar el número de copias de genes (GCN) de genes integrados y encontramos que se perdieron unidades de transcripción individuales. Se han obtenido resultados similares con PAG BRECHA o PAG AOX1 vectores multicopia basados ​​en [24], mostrando así que la integración incompleta del vector no se debe a la columna vertebral de Golden Gate. Confirmamos positivamente la estabilidad de integración post-transformacional para tres de los transformantes en tres cultivos consecutivos en matraz de agitación por lotes sin presión de selección (los números de copias de genes se mantuvieron estables durante más de 15 generaciones Archivo adicional 1: Tabla S1). Por lo tanto, concluimos que las secuencias homólogas repetitivas dentro del vector de expresión (PAG BRECHA y ScCYC1tt secuencias) dio lugar a eventos de recombinación ("bucle de salida" interno) durante la transformación.

    La alta ocurrencia de integración incompleta del vector nos llevó a establecer una colección de 20 promotores diferentes y 10 terminadores de la transcripción (Tabla 1), con el fin de evitar secuencias repetitivas al crear construcciones con múltiples unidades de expresión. Los promotores y terminadores se seleccionaron en función de la regulación transcripcional y la fuerza de expresión de sus genes controlados de forma nativa en experimentos de microarrays publicados [26]. Todos ellos fueron evaluados en varias condiciones relevantes para la producción (Archivo adicional 1: Tabla S2). Además de los promotores establecidos [3, 12], seleccionamos secuencias promotoras novedosas pero no caracterizadas en función de su comportamiento de expresión en datos transcriptómicos de P. pastoris células cultivadas en diferentes fuentes de carbono [26]. Al aplicar esta colección, nuestro objetivo era obtener la capacidad de ajustar la expresión de genes integrados. Idealmente, los promotores con fines de ingeniería celular deberían cubrir una amplia gama de fuerzas de expresión y permitir la expresión constitutiva y sintonizable. Los terminadores de la transcripción se seleccionaron de genes constitutivamente altamente expresados ​​[26], muchos de ellos derivados de genes de proteínas ribosomales. También se informó que los genes ribosomales están regulados al nivel de estabilidad del ARNm [27], que es una de las funciones principales de la 3'UTR contenida en los fragmentos del terminador de la transcripción.

    Validación de mutaciones de la secuencia de Kozak en el P BRECHA secuencia de P. pastoris

    En la configuración de GoldenMOCS, el sitio de fusión Fs2 que une el promotor al GOI contiene el codón de inicio ATG y parte de la secuencia de Kozak, que es importante para el inicio de la traducción en eucariotas. Como este sitio de fusión es una variable fija en el sistema Golden Gate, evaluamos el efecto de la posición "-1" de la PAG BRECHA promotor (posición delante del codón de inicio, Fig.3d) en la expresión del gen informador en P. pastoris. Debido al sitio de fusión "CATG", la "A" nativa en la posición "-1" del PAG BRECHA promotor ("-8" a "-1": AAAACACA) se cambia a "C" (AAAACACC). Tiempo PAG BRECHA las variantes con "A", "T" y "C" en la posición "-1" se comportaron de manera similar, la variante con "G" resultó en un nivel de eGFP más bajo (PAG BRECHA_GATG aproximadamente un 40% menor en comparación con las otras variantes). La secuencia de consenso de Kozak de P. pastoris fue analizado y se encontró que era similar al de S. cerevisiae, which is rich in ‘A’ and poor in ‘G’ bases (Fig. 4). Based on these results, eight bases of the A-rich Kozak consensus sequence were tested in an additional PAG GAP variant (PAG GAP_A8ATG position ‘-4’ and ‘-2’ replaced by ‘A’: AAAAAAAA) and a slightly increased expression of eGFP was found (Fig. 3d). Nevertheless, we chose the ‘CATG’ fusion site for our GoldenPiCS system and kept the ‘GCTT’ fusion site for the GOI-terminator assembly.

    Relative eGFP levels obtained with various elements of the GoldenPiCS toolbox. Expression strength of different promoters in comparison to PAG GAP tested on different carbon sources (a, B), expression levels for PAG GAP-controlled expression in combination with different transcriptional terminators (C), and comparison of PAG GAP variants with alternative ‘-1’ nucleotides (D). Al menos 10 P. pastoris clones were screened to test promoter and terminator function in up to four different conditions: glycerol and glucose excess as present in batch cultivation (“G”, “D”), limiting glucose (“X”) and methanol feed (“M”), both representing fed batch. PAG GAP para PAG SHB17 were tested in ‘G’, ‘D’, ‘X’ and ‘M’ (A). PAG TEF2 para PAG PFK300 were validated in ‘D’, while PAG GUT1, PAG THI11 and MUT-related promoters were tested in putative repressed and induced conditions (‘D’/‘G’, ‘D’+/−100 μM thiamine and ‘D’/M, respectively) (B). PAG GAP variants with alternative ‘-1’ bases were analyzed in glucose excess (‘D’). Relative eGFP levels are related to PAG GAP- controlled expression (A, B), terminator ScCYC1tt (B), or presented as relative value (C)


    Ver el vídeo: Video 6: Aislamiento del plásmido que contiene el gen de interés (Agosto 2022).