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7.12E: Técnicas básicas para manipular material genético (ADN y ARN) - Biología

7.12E: Técnicas básicas para manipular material genético (ADN y ARN) - Biología


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Las técnicas básicas utilizadas en la manipulación de material genético incluyen extracción, electroforesis en gel, PCR y métodos de transferencia.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Distinguir entre las técnicas básicas utilizadas para manipular el ADN y el ARN.

Puntos clave

  • El primer paso para estudiar o trabajar con ácidos nucleicos incluye el aislamiento o extracción de ADN o ARN de las células.
  • La electroforesis en gel depende de los iones cargados negativamente presentes en los ácidos nucleicos a pH neutro o básico para separar moléculas en función del tamaño.
  • Se pueden amplificar regiones específicas de ADN mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para análisis adicionales.
  • La transferencia Southern implica la transferencia de ADN a una membrana de nailon, mientras que la transferencia Northern es la transferencia de ARN a una membrana de nailon; estas técnicas permiten sondar muestras para detectar la presencia de ciertas secuencias.

Términos clave

  • desnaturalización: el cambio de la estructura de plegamiento de una proteína (y por lo tanto de las propiedades físicas) causado por el calentamiento, cambios en el pH o exposición a ciertos químicos
  • electroforesis: método para la separación y análisis de moléculas grandes, como proteínas o ácidos nucleicos, mediante la migración de una solución coloidal de las mismas a través de un gel bajo la influencia de un campo eléctrico.
  • reacción en cadena de la polimerasa: una técnica en biología molecular para crear múltiples copias de ADN a partir de una muestra

Técnicas básicas para manipular material genético (ADN y ARN)

Para comprender las técnicas básicas que se utilizan para trabajar con ácidos nucleicos, recuerde que los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas por nucleótidos (un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada) unidas por enlaces fosfodiéster. Los grupos fosfato de estas moléculas tienen cada uno una carga neta negativa. Un conjunto completo de moléculas de ADN en el núcleo se llama genoma. El ADN tiene dos hebras complementarias unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas. Las dos hebras se pueden separar mediante exposición a altas temperaturas (desnaturalización del ADN) y se pueden volver a recocer por enfriamiento. El ADN puede ser replicado por la enzima ADN polimerasa. A diferencia del ADN, que se encuentra en el núcleo de las células eucariotas, las moléculas de ARN abandonan el núcleo. El tipo más común de ARN que se analiza es el ARN mensajero (ARNm) porque representa los genes codificadores de proteínas que se expresan activamente.

Extracción de ADN y ARN

Para estudiar o manipular ácidos nucleicos, primero se debe aislar o extraer el ADN o ARN de las células. Esto se puede hacer mediante varias técnicas. La mayoría de las técnicas de extracción de ácido nucleico implican pasos para abrir la célula y utilizar reacciones enzimáticas para destruir todas las macromoléculas que no se desean (como la degradación de moléculas no deseadas y la separación de la muestra de ADN). Las células se rompen usando un tampón de lisis (una solución que es principalmente un detergente); lisis significa "dividir". Estas enzimas rompen las moléculas de lípidos en las membranas de la célula y el núcleo. Las macromoléculas se inactivan utilizando enzimas como las proteasas que descomponen las proteínas y las ribonucleasas (ARNas) que descomponen el ARN. A continuación, el ADN se precipita con alcohol. El ADN genómico humano suele ser visible como una masa blanca gelatinosa. Las muestras se pueden almacenar a –80 ° C durante años.

El análisis de ARN se realiza para estudiar los patrones de expresión génica en las células. El ARN es naturalmente muy inestable porque las ARNas están presentes comúnmente en la naturaleza y son muy difíciles de inactivar. Similar al ADN, la extracción de ARN implica el uso de varios tampones y enzimas para inactivar macromoléculas y preservar el ARN.

Electroforesis en gel

Debido a que los ácidos nucleicos son iones cargados negativamente a pH neutro o básico en un ambiente acuoso, pueden ser movilizados por un campo eléctrico. La electroforesis en gel es una técnica que se utiliza para separar moléculas en función del tamaño utilizando esta carga y puede separarse como cromosomas completos o fragmentos. Los ácidos nucleicos se cargan en una ranura cerca del electrodo negativo de una matriz de gel poroso y se empujan hacia el electrodo positivo en el extremo opuesto del gel. Las moléculas más pequeñas se mueven a través de los poros del gel más rápido que las moléculas más grandes; esta diferencia en la tasa de migración separa los fragmentos en función del tamaño. Hay muestras estándar de peso molecular que se pueden analizar junto con las moléculas para proporcionar una comparación de tamaño. Los ácidos nucleicos en una matriz de gel se pueden observar usando varios tintes fluorescentes o coloreados. Los fragmentos de ácido nucleico distintos aparecen como bandas a distancias específicas de la parte superior del gel (el extremo del electrodo negativo) en función de su tamaño.

Amplificación de fragmentos de ácido nucleico por reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se utiliza para amplificar regiones específicas de ADN para su posterior análisis. La PCR se utiliza para muchos fines en los laboratorios, como la clonación de fragmentos de genes para analizar enfermedades genéticas, la identificación de ADN extraño contaminante en una muestra y la amplificación de ADN para su secuenciación. Las aplicaciones más prácticas incluyen la determinación de la paternidad y la detección de enfermedades genéticas.

Los fragmentos de ADN también se pueden amplificar a partir de una plantilla de ARN en un proceso llamado PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). El primer paso es recrear la hebra de plantilla de ADN original (llamada ADNc) aplicando nucleótidos de ADN al ARNm. Este proceso se llama transcripción inversa. Esto requiere la presencia de una enzima llamada transcriptasa inversa. Una vez elaborado el ADNc, se puede utilizar una PCR regular para amplificarlo.

Hibridación, Southern Blot y Northern Blot

Las muestras de ácido nucleico, tales como extractos de ARN y ADN genómico fragmentado, se pueden probar para detectar la presencia de ciertas secuencias. Los fragmentos cortos de ADN llamados sondas están diseñados y marcados con tintes radiactivos o fluorescentes para ayudar a la detección. La electroforesis en gel separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño. Los fragmentos en el gel luego se transfieren a una membrana de nailon en un procedimiento llamado transferencia. Los fragmentos de ácido nucleico que se unen a la superficie de la membrana se pueden sondar luego con secuencias de sonda específicas marcadas radiactivamente o con fluorescencia. Cuando el ADN se transfiere a una membrana de nailon, la técnica se denomina transferencia Southern; cuando el ARN se transfiere a una membrana de nailon, se denomina transferencia Northern. Las transferencias Southern se utilizan para detectar la presencia de determinadas secuencias de ADN en un genoma dado, y las transferencias Northern se utilizan para detectar la expresión génica.


Ver el vídeo: Units u0026 (Julio 2022).


Comentarios:

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